Eletroforese Bidimensional como Ferramenta Protemica

Prof. Carlos Andr O. Ricart CBSP-Centro Brasileiro de Pesquisa em Protenas Departamento de Biologia Celular Universidade de Braslia

Por muitos anos a genmica funcional propagou a noo de que no seria necessrio estudar nveis de protenas para obter-se dados de up and down regulation. Tudo o que era necessrio seria a determinao dos nveis de mRNA

Em 1997, Anderson apresentou um trabalho mostrando a primeira comparao da abundncia de mRNA e protenas correspondentes. A correlao foi de 0,43
Anderson &Seihamer (1997) Electrophoresis 18, 533-537

Esses resultados vem sendo confirmados por outros grupos

A protemica, portanto, parece ser a ferramenta mais apropriada para entender-se o funcionamento dos genes, pois analisa o produto final do genoma

A abordagem protemica exige a separao de protenas com alta resoluo para posterior anlise

Apesar de antiga, at o momento no surgiu uma metodologia capaz de resolver mais protenas simultaneamente do que a eletroforese bidimensional

Eletroforese Bidimensional (2D-PAGE)

1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de OFarrel; Klose ; MacGillivray et al.

Etapas Bsicas:

1- Focalizao Isoeltrica (IEF)

2-Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Por muitos anos a 2D-PAGE sofria do defeito contemplativo

Um gande passo no uso da 2DPAGE ocorreu com o progresso nas tcnicas analticas de identificao de protenas

2D-PAGE: etapas principais

Preparao da amostra Focalizao Isoeltrica SDS-PAGE Deteco Digitalizao e anlise de imagem

Focalizao Isoeltrica (IEF)

As molculas migram sob a ao de um campo eltrico em um gel contendo um gradiente de pH. A migrao se interrompe ao atingirem seu ponto isoeltrico Aplicada a molculas que possam ser tanto positivamente ou negativamente carregadas (anfotricas)

Cadeias laterais das protenas possuem grupos ionizveis carboxlicos(Asp,Glu), aminos (Lys), imidazis (His) e guanidino (Arg) R-COO- + H+ R-COOH R-NH3+ + OHR-NH2 + H2O

A carga lquida de uma protena funo da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga zero no seu ponto isoeltrico (pI) O pI de uma protena pode ser alterado por modificaes qumicas como fosforilaes O pr-requisito para uma boa IEF a formao de gradiente de pH estvel e reprodutvel

Gradientes de pH
A

focalizao isoeltrica realizada em gis de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos:
Tampes

anfotricos (free carrier ampholytes) imobilizados de pH (IPG)

Gradientes

Tampes anfotricos (free carrier ampholytes)

CH2-N-(CH2)X -N-CH2| | (CH2) X (CH2) X | | NR2 COOH R= H ou -(CH2) X -COOH, X=2 Propriedades:boa condutividade e solubilidade no pI, alta capacidade tamponante, baixa interao com a amostra

Gradiente de pH comampholytes
Com o uso dos ampholytes o gradiente de pH formado sob ao de um campo eltrico

Desvantagens: resultado depende do tempo de focalizao, temperatura e efeitos endosmticos

Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

Gradientes imobilizados de pH (IPG)

Gradiente formado com derivados de acrilamida contendo grupos tamponantes (Immobilines) CH2 = CH-C - N - R || | O H R-grupo carboxlico ou amino Mtodo altamente reprodutvel pois os grupos tamponantes esto fixados ao gel Propicia uma alta capacidade de aplicao de amostra e uma baixa condutividade durante a focalizao Gis prontos so disponveis comercialmente

Formao de gel de IPG

Gel de IPG preparado pela mistura linear de duas solues de polimerizao com diferentes Immobilines, ambas contendo monmeros de acrilamida

Diagrama de uma rede de poliacrilamida com Immobilines copolimerizados

-C=O | O-C=O | O-NH+ -NH+ R

|
R R

|
R

-C=O | O-

Reidratao de gis de IPG

Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

Equipamentos usados no CBSP para Focalizao Isoeltrica

MultiPhor II (Amersham Biosciences)

IPGPhor (Amersham Biosciences)

IPG Phor

IEF: Aplicao da amostra

Aplicao Aplicao

direta sobre o gel de IPG,

simultnea reidratao do

gel

Aplicao usando sample cups

A amostra deve ser aplicada em um dos extremos de pH (perto do catodo ou do anodo) onde a maioria das protenas est carregada, minimizando perdas por precipitao

Aplicao durante a reidratao

O gel de IPG reidratado na soluo contendo a amostra Permite aplicao de maior quantidade de protenas (>10 mg) Minimiza a precipitao de protenas durante a entrada no gel, principalmente para protenas de membrana Evita a manipulao exigida durante a aplicao usando sample cups

Equilibrio do gel de IPG

15-30 min em soluo contendo Tris, Uria, Glicerol, DTT, SDS e bromofenol 15-30 min em soluo contendo Tris, Uria, Glicerol, iodacetamida, SDS e bromofenol Aps equilbrio retirar excesso do tampo de equilbrio lavando com tampo de corrida SDS-PAGE

Segunda dimenso SDS-PAGE

Sistema horizontal. Ex.Mutiphor II Electrophoresis unit (Pharmacia Biotech) Sistema vertical. Ex. SE 600, IsoDalt (Amersham), Investigator (Millipore), Protean II xi (BIO-RAD), etc.

CH2= CH | C=O | NH2 Acrilamida CH2= CH | C=O | NH | CH2 | NH | C=O | CH2=CH

Metileno bisacrilamida

...- CH2 - CH - CH2- CH - CH2 - CH -... | | | C=O C=O C=O | | | NH2 NH NH2 | CH2 | NH | C=O | ...-CH -CH2-CH - CH2 - CH -... | | C=O C=O | | NH2 NH2 poliacrilamida

Tamanho do poro

T- concentrao total de acrilamida

T= (a+b) x 100 V

C - porcentagem de crosslinker
C = b x 100 a+b

SDS-PAGE-sistema vertical

Vantagens: Possibilidade de uso de equipamento preexistente no laboratrio, permite corridas simultneas de vrios gis dependendo do sistema utilizado

SDS-PAGE-Sistema horizontal

Vantagens:Melhor resoluo segundo a. Gorg, possibilidade de uso de gis precasted Desvantagens: permite apenas duas corridas simultneas

Como preparar a amostra para a 2DPAGE?

Composio dos tampes de amostra

Tampes de amostra normalmente possuem:

Uria Detergente Agente redutor Anflitos Inibidores de proteases

Preparao da Amostra
Para

a focalizao isoeltrica, as protenas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas

processo de solubilizao deve, portanto, atingir os seguintes objetivos:

Quebrar interaes macromoleculares incluindo todas as interaes no covalentes e as pontes dissulfeto Prevenir modificaes nas protenas Manter as protenas em soluo durante a 2D-PAGE

Agentes Redutores 2-mercaptoetanol era usado nos primrdios. Sua ao tamponante destri o gradiente de pH na regio bsica. DTT o mais utilizado. Obs: protenas com muita cistena no so totalmente reduzidas com DTT. Tributilfosfina (TBP) o mais potente agente redutor disponvel. Obs: voltil, txico e requer solvente orgnico para dissolver em gua. Tris(carbixietil) fosfine (Pierce Co.) uma fosfina hidrossolvel.

Rompimento de interaes no covalentes

1-

Agentes caotrpicos:

Uso de reagentes caotrpicos, como a uria, por alterarem os parmetros do solvente exercem profundos efeitos sobre todos os tipos de interaes no covalentes. A tiouria um agente caotrpico mais eficiente que a uria, mas pouco solvel em gua. A mistura uria- tiouria bastante eficiente.

Paba et al (2003) Proteomics, in press

Cuidado com a carbamilao causada pela uria! - A uria em gua existe em equilbrio com cianato de amnio (cujos nveis aumentam com a temperatura. - Cianato pode reagir com aminas (N-terminal ou lisinas). - Consequncia: heterogeneidade artefactual de carga, bloqueio N-terminal, etc. - Como evitar: grau de pureza da uria, evitar temperaturas acima de 37C, desionizar solues de uria e usar scavengers de cianato (amina primria).

Rompimento de interaes no covalentes 2- Detergentes: Rompem interaes hidrofbicas Para a focalizao isoeltrica, no podem ter carga lquida.Devem ser no-inicos ou zwitterionicos SDS deve ser evitado!! Os mais compatveis com as necessidades so o Triton X-100 e o CHAPS

Mantendo as protenas intactas

Hidrolases (fosfatases, glicosidases e proteases) Proteases so resistentes uria e a detergentes Inibidores de proteases nem sempre so suficientes Solubilizao em SDS quente Homogeinizao da amostra em TCA diludo ou TCA-acetona

Paba et al (2003). Proteomics, in press

Remoo de sais
Os sais interferem diretamente no processo eletrofortico. Eles migram atravs do gradiente de pH produzindo calor e acumulam-se nas duas extremidades. Isso causa zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuio do campo eltrico. Nessa zonas, as protenas no focalizam e aparecem como faixas. As tiras de IPG incham nessas zonas de aalta condutividade devido ao acmulo de gua.Remoo por precipitao ou dilise.

Deteco

Fatores importantes:
Faixa dinmica de deteco Linearidade Reprodutibilidade entre experimentos Variabilidade inter protena Compatibilidade com mtodos de identificao

Principais mtodos
Coomassie Blue Nitrato de Prata Reagentes fluorescentes Marcao radioativa

Apesar da enorme quantidade de trabalho protemico, continuamos observando a ponta do iceberg. A grande maioria das protenas protenas raras (e preciosas) ainda esto escondidas. Todos esto identificando as mesmas protenas (as mais abundantes)

Por que?

A abundncia das protenas varia muito Ex: Nas clulas Humanas

Actina (108 cpias /clula) Receptores celulares e fatores de transcrio (102-103 cpias /clula) Dinamic range 105-106 !!!! Dinamic range 2D-PAGE = ~104

Obs: a situao ainda pior em certas amostras como o soro sanguneo onde albumina presente em concentraes de 40 mg/mL e citocinas em pg/mL . Faixa dinmica de 109

Como resolver este problema?

Uma opo o pr fracionamento da amostra

 Tipos

de fracionamento Celular Cromatogrfico Eletrofortico

Outra opo o uso de gradientes estreitos de pH (narrow pH gradients)

Paba et al (2003) Proteomics, in press

Limitaes da abordagem 2DPAGE/MS

Dificuldade de automao Incapaz de detectar, identificar e quantificar todas as protenas de amostras complexas simultaneamente Dificuldade de resolver protenas extremamente cidas ou bsicas, assim como as muito hidrofbicas.

2D or not 2D?

Se o objetivo prover uma lista de todas as protenas presentes em uma amostra, metodologias baseadas em cromatografia multidimensional acoplada espectrometria de massa em sequncia (MS/MS) pode fornecer resultados superiores Se o objetivo for observar mudanas quantitativas na expresso de protenas ou suas modificaes ps traducionais durante um processo biolgico, os gis bidimensionais ainda so inigualveis.

Tripomastigotas

Amastigotas