Cintica Enzimtica

Fermentacin enzimtica

Fermentaciones

Son reacciones donde una materia prima orgnica es convertida en productos por la accin de microorganismos o enzimas

Fermentaciones enzimticas vs. microbiolgicas

Fermentaciones

el agente cataltico, la enzima, no se reproduce a s misma, sino que acta simplemente como un agente qumico ordinario A
E

enzimticas:

Fermentaciones microbiolgicas: el agente

cataltico, la clula o microorganismo, se reproduce a s misma A

C

R + C

Cintica de Michaelis- Menten

rR

CEO

CA A
E

Cintica de Michaelis - Menten

Considerando la reaccin enzimtica en dos pasos elementales: A+E

1

R+E

Donde: CEO CE CX

CEO = CE + CX
Concentracin total de enzima Concentracin de enzima libre Concentracin de enzima atada al reactante

Para simplificar la expresin de velocidad se pueden hacer una serie de suposiciones: 1.CX = 0 o CE = CEO 2.CX = 0 /
~ ~

3.K = CX / CACE = k1/k2

4.d CX / dt = 0

Expresiones de velocidad

Con las suposiciones 1 y 3: rR = k1 k3 CA CEO

k2

Con las suposiciones 1 y 4: rR = k1 k3 CA CEO k2+k3

No dan Cintica de orden 0 y 1o. Respecto a A

Expresiones de velocidad

Con las suposiciones 2 y 3 (Michaelis Menten):

rR = k3 CA CEO k2 /k1 + CA
Buenas predicciones Posibles mecanismos

Con las suposiciones 2 y 4 (Briggs Haldane): rR =

k3 CA CEO (k2+k3)/k1 + CA

Cintica de Michaelis - Menten

A+E
1 2

R+E

CEO = CE + CX

d CX/dt = 0

rR = k3 CA CEO CM + CA

(Ec. 1)

Donde CM = Constante de Michaelis Menten = (k2+k3)/k1

Significado de CM

Dado que:

d CX/dt = 0 = k1CACE - (k2+k3) CX

y
CEO = CE + CX

Entonces: CX / CE = CA / CM

Significado de CM

Por consiguiente, cuando:

CA = CM >> CM << CM

CA

CA

La mitad de la enzima est en su forma libre y la mitad combinada La mayora de la enzima se encuentra formando el complejo X La mayora de la enzima est en su forma libre

Cintica de Michaelis - Menten

r rmax
1er orden CA<<CM Orden 0 CA>>CM

r = rmax / 2

CA = C M

CA

Bioreactor de lote o flujo de tapn

Al tiempo t=0 CAo CEo CRo = 0

Al tiempo t
CA CE = CEo

CR

Bioreactor de lote o flujo de tapn

CM ln CAO +(CAO - CA) = k3 CEO t

(Ec. 2)

Trmino de primer orden

Trmino de orden cero

Bioreactor de lote o flujo de tapn

Alta CA : Orden 0 CA = CM

CA

Baja CA: 1er. orden

Valores de las constantes k3 y CM

La Ec. 2 puede rearreglarse de la siguiente forma:

CAo CA = -CM + k3CEo t (Ec. 3) ln(CAo/CA) ln(CAo/CA)

Valores de las constantes k3 y CM

C Ao
Orden 0

CAo CA
ln(CAo/CA)
1er. orden Pend. = k3

0
-CM

CEo t

CM / k3

CM+CAo
k3

ln(CAo/CA)

Valores de las constantes k3 y CM

C Ao
Orden 0

CAo CA
ln(CAo/CA)
1er. orden Pend. = k3CEo

0
-CM

CM / k3CEo

CM+CAo
k3CEo

ln(CAo/CA)

Bioreactor de flujo mezclado

CAo CEo CRo = 0

CA
CE = CEo CR

Bioreactor de flujo mezclado

t = CAo CA = (CAo CA)(CM + CA) -rA k3 CEo CA

k3 CEo t = (CAo CA)(CM + CA) CA

Valores de las constantes k3 y CM

(Flujo mezclado)

C Ao
Orden 0

CA
1er. orden Pend. = k3

0
-CM

CEo CA t

CM / k3

CM+CAo
k3

CAo - CA

Valores de las constantes k3 y CM

(Flujo mezclado)

C Ao
Orden 0

CA
1er. orden Pend. = k3CEo

0
-CM

CA t

CM / k3CEo

CM+CAo
k3CEo

CAo - CA

Adaptacin directa de la ecuacin M-M con datos de velocidad-concentracin

1.

Obtener datos experimentales de r vs. C

i.

ii.

Para flujo mezclado: rR = CAo CA t Para lote o flujo fijo: rR = - d CA

dt

Graficar r vs. C para encontrar k3 y CM

i. ii.

Grfica Eadie Hofstee Grfica Lineweaver - Burk

Grfica de Eadie

Rearreglando la ecuacin de Michaelis Menten: -rA = k3 CM CEo -rA CEoCA

Grfica de Eadie
rAmax = k3
Rgimen de orden 0

Pend. = -CM -rA/CEo

Rgimen de
1er. orden 0 k3 / C M

-rA/CEo CA

Grfica de Eadie
k3 CEo
Rgimen de orden 0

-rA

Pend. = -CM

Rgimen de
1er. orden 0 k3 CEo / CM

-rA / CA

Grfica de Lineweaver

Rearrgando de otra manera la euacin de M-M: 1 - rA = CM 1 + k3CEo CA 1 k3CEo

Grfica de Lineweaver
1/ -rA Rgimen de Pend. = CM k3CEo 1 / k3CEo Rgimen de orden 0 1/CM 1/CA 0 1er. orden

Inhibicin por una sustancia extraa

Se le llama inhibidor a una sustancia B, cuya presencia retarda la velocidad de la reaccin enzima-sustrato. En base a su modo de accin, la inhibicin puede ser:
Inhibicin Inhibicin

competitiva no competitiva

Inhibicin por una sustancia extraa

COMPETITIVA

NO COMPETITIVA

Importancia en farmacologa
Accin de medicamentos

Estudio de enzimas

Estudio Bioqumico de enfermedades

e inhibicin
Desarrollo nuevos medicamentos

Sntesis de qumico bloquear enzima

Cintica de inhibicin competitiva

Con A y B compitiendo por el mismo sitio de la enzima, se tiene

A+E B+E

1 2 4 5

X Y

R+E

(Ec. 4)

(Ec.5)

La velocidad de reaccin es rR = d CR = k3CX

(Ec.6)

dt

Cintica de inhibicin competitiva

Aplicando Briggs-Haldane a las ecuaciones 1 y 2

(Ec. 7)

d CX/dt = 0 = k1CACE (k2 + k3)CX d CY/dt = 0 = k4CBCE k5 CY

(Ec. 8)

Y haciendo el recuento de la enzima en sus diferentes formas CEo = CE + CX + CY

(Ec.9)

Cintica de inhibicin competitiva

Finalmente, suponiendo que:

CBo = CB + CY

=0

o CBo = CB
o CBo >> CY

o k4 / k5
o CBo >> CEo

Cintica de inhibicin competitiva

rR = k3CEoCA = k3CEoCA CM+CA+NCBCM CM(1+NCB)+CA CM = k2 + k3 k1 N= k4 k5 mol m3 m3 mol

Donde:

Cintica de inhibicin no competitiva

A se une a un sitio de la enzima y B a otro diferente pero detiene la accin de A

A+E

1 2

R+E

(Ec. 10)

B+E
B+X

4
5 6 7

Y
Z

(Ec. 11)
(Ec. 12)

La velocidad de reaccin es rR = d CR = k3CX

(Ec.13)

dt

Cintica de inhibicin no competitiva

Aplicando Briggs-Haldane a las ecuaciones 1 y 2

(Ec. 15)

d CX/dt = 0 = k1CACE + k7CZ - (k2 + k3)CX - k6CBCX

d CY/dt = 0 = k4CBCE k5 CY
d CZ/dt = 0 = k6CBCX k7 CZ

(Ec. 16) (Ec.17)

Y haciendo el recuento de la enzima en sus diferentes formas CEo = CE + CX + CY + CZ

(Ec.18)

Cintica de inhibicin no competitiva

rR = k3CEoCA = CM+CA+NCBCM +LCACB k3CEoCA/(1+LCB) CM 1+NCB +CA 1+LCB

Donde: CM = k2 + k3 k1 N = k4 k5 L= k6 k7

Inhibicin competitiva
Baja

Bioreactor de lote o flujo de tapn

Alta

C Ao

CB = 0

CB

CB

CAo CA
ln(CAo/CA)

Pend. = k3

0
-CM

CEo t
CM / k 3
CM(1+NCB)
k3

ln(CAo/CA)

Inhibicin no competitiva
Baja Alta

Bioreactor de lote o flujo de tapn

C Ao
CB = 0
CB CB

CAo CA
ln(CAo/CA)

Pend. =

k3 1 + LCB

0
-CM

CEo t
CM / k 3
CM(1+NCB)
k3

ln(CAo/CA)

Inhibicin competitiva
Baja

Bioreactor de flujo mezclado

Alta

C Ao

CB = 0

CB

CB

CA

Pend. = k3

0
-CM

CEo CA t
CM / k 3
CM(1+NCB)
k3

Cao - CA

Inhibicin no competitiva
Bioreactor de flujo mezclado
Baja Alta

C Ao

CB = 0

CB

CB

CA

Pend. =

k3 1 + LCB

0
-CM

CEo CA t
CM / k 3
CM(1+NCB)
k3

Cao - CA

Inhibicin competitiva
k3
Pend. = -CM

Datos de velocidad vs. concentracin

-rA/CEo

Pend. = -CM(1+NCB)

Alta CB

Baja CB

CB = 0 k3 / CM

k3 / CM(1+NCB)

-rA/CEo CA

Inhibicin no competitiva
k3
k3/(1+LCB) Pend. = -CM

Datos de velocidad vs. concentracin

-rA/CEo

Pend. = -CM(1+NCB)

Alta CB

Baja CB

CB = 0 k3 / CM

k3 / CM(1+NCB)

-rA/CEo CA

Inhibicin por substrato

El exceso de substrato A puede causar interferencia en los sitios activos de la enzima

A+E A+X

1 2 4 5

X Y

R+E

(Ec. 19)

(Ec.20)

La velocidad de reaccin es rR = d CR = k3CX

(Ec.21)

dt

Inhibicin por substrato

Aplicando Briggs-Haldane a las ecuaciones 1 y 2

d CX/dt = 0 = k1CACE + k5 CY (k2 + k3)CX - k4CACX

(Ec. 22)

d CY/dt = 0 = k4CACX k5 CY

(Ec. 23)

Y haciendo el recuento de la enzima en sus diferentes formas CEo = CE + CX + CY

(Ec.24)

Inhibicin por substrato

rR = k3CEoCA CM + CA + NCA2

Donde: N = k4 k5

Grfica de bioreactor de lote o flujo de tapn

CAo N=0
Baja N Alta N

Cao - CA lnCAo/CA CM / k3 CEo t

(CM+C Ao)/ k3

(CM+C Ao+2NCAo)/ k3

lnCAo/CA

- CM

Grfica de velocidad vs. concentracin

rR / CEo k3

Baja N Alta N

0 k3 / 2C M

rR / Ceo CA
k3 / C M