PENGGUNAAN LABELING

Visualisasi Sel
Makhluk kecil seukuran sel : Disaksikan pertama kali oleh Antonie van Leeuwenhoek (Delft, Nederland, 1632 1732) Tahun 1673, Leeuwenhoek membuat alat mikroskop sederhana Ia menemukan Protista (1674), Bacteria (1676), spermatozoa (1677) dan serat otot (1682) Ia menyebut semua itu viva animalcula (makhluk hidup kecil)

 Sejak itu, mikroskop berkembang dan mencapai bentuknya yang seperti sekarang ini di abad ke 18-19 Louis Pasteur (1822-1895) memastikan di bawah mikroskop keberadaan berbagai mikroba yang menimbulkan penyakit. Pasteur juga membuktikan dengan menggunakan mikroskop, bahwa pembusukan makanan disebabkan oleh mikroba yang tumbuh dan berkembang biak di makanan tersebut. Pengamatan Pasteur germ theory

Gagasan tentang Sel

Semua itu pengamatan yang dilakukan terutama terhadap makhluk sel tunggal Robert Hook (1635-1703) menggunakan mikroskop untuk melihat sayatan tipis gabus Hook melihat satuan struktur rongga yang seragam, mengingatkan kpd ruang-ruang kecil di biara yang masing-masing didiami seorang rahib & dinamai sel (cell)

 Sejak itu istilah sel dipakai untuk gambarkan satuan terkecil, baik secara struktur mau pun fungsi, dari makhluk hidup Sel sebagai makhluk hidup dapat berdiri sendiri makhluk sel tunggal (diamati pertama kali oleh Leeuwenhoek) Bagian dari makhluk banyak sel (pertama kali dilaporkan Hook) Tetapi penampilan sel makhluk sel tunggal sel dari makhluk sel banyak Pada yang terakhir, sel terikat satu sama lain dg suatu cara & dg suatu bahan

 Dengan sendirinya masalah visualisasi kedua macam sel berbeda Makhluk sel tunggal : bgaiamana membedakan dengan latar belakang Makhluk sel banyak : bagaimana membedakan berbagai jenis sel dari suatu organisme dan bagaimana membedakan tiap sel dari latar belakang Masalah ini diselesaikan dengan pewarnaan (staining) Pewarnaan sel dari makhluk 1 sel pewarnaan sel dari makhluk banyak sel

Makhluk Sel Tunggal

Hidup sendiri-sendiri. Kelompok hanya koloni : sel-sel bebas satu sama lain Seragam hanya perlu dibedakan dengan latar 2 cara pewarnaan : Pewarnaan negatif : cukup mewarnai latar belakang, sel sendiri tidak ditembus zat warna pewarnaan dengan suspensi karbon (tinta Cina / tinta India) atau pewarna nigrosin (zat warna sintetis berwarna hitam)

 Pewarnaan badan sel : pada bakteri yang terpenting pewarnaan Gram yang bertujuan mewarnai dinding bakteri. Dinding bakteri kaya peptidoglikan dan berwarna biru oleh pewarna kristal ungu sesudah bereaksi dengan I2 Gram (+): dinding sel menahan pewarna Bila ada dinding kedua lipopolisakarida (LPS), larut o/ alkohol pelarut, pewarna kristal ungu + I2 masuk sel warna merah Gram (-) : dinding sel tidak menahan pewarna

Organisme Banyak Sel

Pewarnaan Haematoxylin-Eosin (HE) Melihat struktur sel dan bagian-bagiannya Melihat bagaimana sel dihubungkan satu dg lain oleh jaringan ikat inti dan sitoplasma harus terlihat Jaringan ikat yang menghubungkan sel harus tampak Inti berwarna biru oleh haematoxylin Sitoplasma & jar ikat merah oleh eosin

Pewarna H-E
Haematoxylin Eosin

 Pewarnaan H-E dan yang serupa hanya memperlihatkan inti, sitoplasma dan jaringan ikat Bagian lain dalam sel, apa lagi distribusi protein tertentu seperti enzim dan berbagai regulator tidak terlihat Fisiologi sel yang lebih rinci tidak diketahui Status metabolisme sel juga tidak difahami

Berbagai Cara untuk Mengatasi

Memperbesar daya pisah dengan mengatur cahaya yang masuk : - Mikroskop elektron - Sinar elektron mudah diarahkan intensitasnya - Mudah difokuskan dengan lensa elektromagnetik dan elektrostatik - Benturan elektron ke permukaan suatu molekul akan hasilkan pendaran

 Pendaran tersebut akan diproyeksikan ke layar monitor yang berpendar pembesaran dapat mencapai 1.1054.105 x Dapat memperlihatkan berbagai struktur subseluler lain selain inti Dapat perlihatkan arsitektur dan anatomi berbagai sel yang berbeda Ada 2 jenis : transmission electron microscop (TEM) & scanning electron microscop (SEM) TEM : 2D, tembus ke dalam sel SEM: 3D, terbatas permukaan

Perbandingan Gambar Lekosit PMN secara TEM dan SEM

TEM SEM

Distribusi Senyawa dalam Sel

Apakah sel merupakan suatu kantong dengan isi campur aduk tidak tertata ? Gambaran yang diperoleh dari pewarnaan H-E menunjukkan struktur umum yang khas bagi sel Struktur yang selalu ada dan muncul suatu keteraturan ada tatanan tertentu bukan suatu campur aduk yang acak Gambaran TEM sel menunjukkan tingkat struktur (=organisasi) yang canggih

 Struktur / organisasi yang canggih pasti mempunyai komponen yang tersusun rapi di tempat masing-masing Berbagai senyawa dalam sel selalu ditemukan sama / mirip, baik makromolekul mau pun mikromolekul Senyawa tersebut niscaya berada pd tmpt tertentu dan muncul /mengalir menurut cara-cara tertentu Teknik mikroskopi biasa, meski pun dengan resolusi dan pembesaran yg , tdk dapat menentukan

 Salah satu aplikasi awal dari penggunaan teknik ialah untuk melihat, bagaimana nukleotida digunakan dalam replikasi DNA gambaran garpu replikasi DNA (DNA replication fork) Sekaligus jelaskan mekanisme replikasi

Alternatif senyawa radioaktif untuk penanda

Penggunaan senyawa radioaktif, walau pun sangat canggih dan akurat, mempunyai banyak masalah (T1/2, pembuangan, harga yang mahal, peralatan, perlindungan dan SDM khusus) harus ada alternatif lain 1. penggunaan senyawa berfluoresensi yang diikatkan ke antibodi anti dari zat yang dipelajari 2. penggunaan enzim yang diikatkan ke antibodi anti zat yang dipelajari

Penggunaan senyawa berfluoresensi sebagai penanda

Fluoresensi : pemancaran cahaya oleh suatu senyawa, bila senyawa tersebut disinari oleh suatu cahaya dengan < sinar yang dipancarkan senyawa tsb (Stokes 1852) Teknik pelacakan keberadaan suatu molekul dalam sel menggunakan antibodi thd molekul tersebut dan yang sudah ditandai dengan suatu fluoresens dan dilihat dengan mikroskop fluoresens dikembangkan o/ Albert Coon (1912 1978) Fluoresens paling umum FITC & rhodamin

Fluoresence Iso Thio Cyanate (FITC)

Rhodamin

Imunofluoresensi Sel Otot Polos

Imunofluoresensi jaringan glomerulus

Enzim Sebagai Penanda

Penggunaan fluoresens sebagai penanda telah sangat mempermudah penelitian tingkat sel dan jaringan pada berbagai laboratorium yang tidak mempunyai fasilitas mikroskop elektron Kelemahan : harus tersedia mikrokop khusus : mikroskop fluoresensi Sediaan kebanyakan harus segar (potong beku), tidak dapat gunakan parafin blok biasa Alternatif : gunakan enzim sebagai pengganti zat fluoresensi

 Dikembangkan oleh Stratis Avrameas (1966), Pierce (1967) dan Wide (1967) Enzim yang digunakan : Sedapat mungkin tidak ada dalam bahan yang diperiksa Dapat diarahkan untuk memberi reaksi warna yang langsung dapat dilihat dengan mikroskop biasa : peroksidase dan fosfatase Dapat diamplifikasi : sistem avidin-biotin Menghasilkan kuantitatif ELISA dan teknik visualiasi sel immunohistochemistry (IHC) keduanya atas prinsip yang sama

 Imunohistokimia (IHC)

Imunoenzimatik kuantitatif (ELISA)

IHC untuk melacak antigen kanker pada Ca-mammae

Aplikasi
RIA : Radioimmunoassay menentukan ab at ag menggunakan reagen bertanda zat radioaktif RAST : Radioallergosorbent test RIA yg khusus digunkan utk menentukan antibodi spesifik IgE

 IRMA : Immunoradiometric assay periksa ag dg cara menambahkan ab yg bertanda zat radioaktif ELISA : utk menentukan ab - antigen ikatkan zat padat - + ab yg akan diperiksa - + ag yg bertanda enz (ex peroksidase, fosfatase) - substrat kromogenik yg bila brx dg enz terjadi perub warna - perub warna sesuai dg jmlh enz yg diikat

Tiamin bebas Tiamin avidin

Biotin + peroksidase

Konsentrasi, 20, 30, 40, 50

warna

Konsentrasi tetap mis, 50

Intensitas warna ~ biotin-peroksidase ~ avidin