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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR FACULDADE DE FARMCIA , ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A FARMCIA

Mestranda: Andressa Hellen Profa: Ndia Accioly

Fortaleza, 2013.

Introduo
TERAPIA GNICA

Terapia gnica um procedimento mdico que envolve a modificao gentica de clulas como forma de tratar doenas. Interveno mdica baseada em modificaes do material gentico em clulas vivas.
Qualquer procedimento teraputico em que sequncias nucleotdicas so intencionalmente introduzidas ou modificadas em clulas/tecidos humanos.

Definio

Foi assim que surgiu o conceito de terapia gnica (ou ainda geneterapia), que prope, por meio de engenharia gentica e com a ajuda de vetores chegar at os rgos, tecidos e clulas em que h genes defeituosos para trat-los. Por tratamento, os cientistas buscam desativar o gene doente e reprogram-lo para produzir as protenas certas ou parcialmente funcional ou ainda adicionar novos genes em substituio aos que no funcionam normalmente. O objetivo, seja qual fora o tipo de interveno, fazer o DNA aprender a ler um novo cdigo ou seja, corrigir o problema na sua origem.

Histrico

Em 1990, foi realizado nos Estados Unidos o primeiro Protocolo Clnico de Terapia Gnica em humanos, em duas crianas portadoras da imunodeficincia combinada severa. O sucesso parcial desse protocolo levou a uma exploso no desenvolvimento de vrios estudos com perspectivas de uso teraputico dos genes. O aumento na quantidade de protocolos clnicos reflete o fato de que h grandes esperanas de sucesso da terapia gnica para combater doenas que afligem a sociedade h muito tempo, com poucas perspectivas na medicina clssica. Entre as grandes mudanas recentes, destacamos o uso de molculas de RNA dupla-fita que agem como silenciadores gnicos atravs de mecanismos de RNA interferncia (RNAi).

Histrico

O trabalho pioneiro descrito por Oswald T. Avery e seus colaboradores em 1944 j mostrou que possvel transferir genes de uma cepa bacteriana patognica para outra no-patognica, identificando o DNA como portador da informao gentica. Essa descoberta fundamental foi logo seguida pela proposta da estrutura dupla-hlice do DNA, por James Watson e Francis Crick em 1953. Estavam lanadas bases para a busca de uma forma de inserir genes saudveis em indivduos que deles necessitassem, hiptese que foi aventada em 1964. O isolamento do primeiro gene, por Jon Beckwith e colaboradores em Harvard (1969), levou a declaraes reforando essa possibilidade. No entanto, teve incio tambm uma polmica sobre a segurana da engenharia gentica e possibilidades de sua utilizao para propsitos de eugenia. Esse debate estendeu-se durante toda a dcada de 1970 e culminou na criao de legislaes adequadas de segurana em diversos pases.

Histrico

Em 1977, os pesquisadores Michael Wigler e Richard Axel conseguiram a primeira correo gentica propriamente dita em clulas de mamfero cultivadas in vitro. Esses pesquisadores inseriram o gene que codifica a enzima timidina quinase em clulas portadoras de deficincia nesse gene. A metodologia utilizada, com DNA purificado, apesar de fornecer dados inequvocos, ainda era pouco eficiente. Ganhou fora, ento, a proposta aventada anteriormente de utilizar vrus no-patognicos como vetores transportadores de genes. Essa idia gerou intensas pesquisas e j nos anos de 1983 e 1984 foram propostos os primeiros sistemas de vetores derivados de trs espcies virais.

Histrico

No incio do sculo XXI, com o seqenciamento do genoma humano e o desenvolvimento das ferramentas de comparao de genes baseada na informtica, foi desvendado um universo jamais imaginado anteriormente. Essas ferramentas foram um apoio fundamental na medida em que vrias doenas humanas eram, custa de muito trabalho, relacionadas a defeitos em genes especficos. Os dados do genoma humano foram anunciados vrias vezes com pompa e euforia. identificavam que, com a revelao do Livro da Vida, estaramos prximos de resolver problemas seculares. De fato, com esses dados foi possvel identificar pelo menos 70.000 defeitos genticos em seres humanos.

A capacidade de interferir na constituio gentica de um indivduo, por meio da terapia gnica, surge ento como uma espcie de tbua de salvao para resolver problemas relacionados sade humana, pela cura de doenas genticas herdadas dos pais, ou mesmo de doenas que podem ser adquiridas durante a vida, como o cncer, doenas do corao e infeces virais

Aplicaes
Na prtica, porm, o tratamento ainda passa por testes que avaliam sua segurana e eficcia para os seres humanos, e, alm disso, os cientistas acreditam que nem todos os pacientes podero se beneficiar desses avanos.

Pr-condies realizao da terapia gnica Ser portador de alguma das doenas caracterizadas pela mutao de um ou mais genes. Segundo os especialistas, os melhores candidatos so aqueles que possuem um transtorno causado por um nico gene defeituoso, uma vez que fica mais fcil entender o mecanismo de codificao das protenas e, consequentemente, a manifestao da doena. Os pesquisadores j conhecerem a biologia da doena gentica que tecidos so atingidos pela mutao gnica, como as protenas codificadas pelo gene mutante atuam. Esta condio essencial para que os especialistas produzam em laboratrio a cpia de DNA do gene mutante, ou seja, o gene teraputico, que ser inserido no organismo do paciente por meio de um vetor. Tambm os ajuda a definir o melhor mtodo para aplicar a terapia desde o tipo de vetor at o melhor procedimento para faz-lo chegar at as clulas-alvo. O gene com mutao no do tipo dominante negativo. Se fosse, isso significa que o gene mutante produz uma protena capaz de impedir a ao do gene teraputico e, neste caso, o sucesso da terapia gnica mais difcil, porque requer o uso de tcnicas de apoio.

Os riscos da terapia gnica:


Resposta imune a protena produzida pelo gene inserido causando inflamao. Mutao insercional. O gene saudvel introduzido pode promover a sntese de muita protena, antes defeituosa, levando a outros problemas. Outros genes podem ser acidentalmente entregue as clulas. Os vetores pode atingir outras clulas no afetadas pelo defeito gentico, e ento provocar algum problema. O vetor viral pode se tornar infectivo/ contagioso.

Procedimentos tcnicos necessrios terapia gnica em humanos (FDA):


isolamento do gene e suas seqncias reguladoras determinar quais so as clulas afetadas dispor de um mecanismo eficiente (vetores) para inserir o gene nas clulas especificadas. dispor de tempo para anlise. que todos os procedimentos no apresentem efeitos colaterais indesejveis.

Estratgias teraputicas

Transferncia

(em pacientes com mutao no funcional ou deleo de um gene )

Correo

(reverter mutao especfica em um gene alvo)

Amplificao

(aumentar a expresso do gene alvo)

Induo de morte

(introduo de gene killer)

Silenciamento

(inibio da expresso de um gene)

Vetores para Transferncia gnica

Transferncia gnica
Vetores no virais

Mtodos fsicos ; Mtodos qumicos ;

Vetores virais Mtodos biolgicos;


Retrovirus Herpes simplex virus Adenovrus

Adenovrus associados

A escolha do mtodo a ser empregado feita de acordo com a patologia, a clula ou tecido-alvo, o tamanho e tipo de transgene a ser expresso e o tempo e quantidade de expresso que se deseja obter, entre outros fatores.

Vetores de transferncia gnica


Caractersticas ideais:

capacidade de acomodao de um transgene de tamanho ilimitado; Baixa imunogenicidade e citotoxicidade; Expresso estvel do transgene,; direcionamento para tipos especficos de clulas ou tecidos; baixo custo, fcil produo e manipulao e ainda possibilidade de regular a expresso do gene exgeno no tempo e/ou na quantidade.

Vetores no virais

Mais recentes na terapia gnica No imunognicos Uso repetido Sem mutao insercional Transduo in vivo limitada

Principais barreiras: 1.Entrada na clula 2.Degradao citoplasmtica 3.Transporte at o ncleo 4.Entrada no ncleo

EGF P

pREGFP 11.2 kb

Mtodos fsicos:

Microinjeo: consiste na introduo de uma pequena quantidade de DNA diretamente no ncleo da clula-alvo com o auxlio de um aparelho denominado micromanipulador. Vantagens Desvantagens

Pequena quantidade de DNA; o nmero de clulas que pode Evita a degradao ser transformado geralmente citoplasmtica muito baixo. Facilidade de aplicao Requer pessoal treinado e especializado

Produo de trangnico

A aplicao est restrita a tecidos com nvel baixo de endonuclease Apresenta problemas tcnicos e ticos.

Mtodos fsicos:

Eletroporao: Neste sistema, pulsos eltricos alternados so aplicados a clulas


que esto em contato com uma soluo de DNA plasmidial. A corrente gerada capaz de formar poros na superfcie celular, facilitando a entrada do material gentico nas clulas.

Vantagens
Bastante eficiente Alta taxa de transformao

Desvantagens
Elevada morte celular

Mtodos fsicos:

Biobalstica ou gene gun: microesferas de ouro ou tungstnio cobertas com DNA so aceleradas por um gs carreador, que projeta estas esferas contra clulas, promovendo a entrada deste DNA no ncleo das clulas bombardeadas.

Vantagens
Bastante eficiente Alta taxa de transformao

Desvantagens
Expresso transitria Pode causar leso celular

Mtodos qumicos
Utilizam caractersticas do DNA e das membranas celulares para, utilizando compostos qumicos, garantir a entrada de material gentico nas clulas.

Em geral, os compostos utilizados so catinicos, ou seja, possuem carga total positiva. Assim, estes compostos interagem com as cargas negativas dos grupamentos fosfato do DNA e formam complexos.

Tais complexos tm tambm uma carga geral positiva, eliminando a repulso de cargas existente entre o DNA e os domnios extracelulares da maioria das protenas de membrana, que tambm tm carga negativa.
Assim, a entrada do complexo na clula por mecanismos celulares normais, como a endocitose, facilitada.

Mtodos qumicos

Fosfato de clcio : Dextran Lipossomos HACS

Mtodos biolgicos

Sistemas biomoleculares especficos de transferncia, recombinao e expresso gnica; Vetores por excelncia; Vm evoluindo h milhes de anos na natureza em associao com bactrias, plantas e animais; Principais barreiras dos vetores no virais: 1.Entrada na clula 2.Degradao citoplasmtica 3.Transporte at o ncleo 4.Entrada no ncleo

Vetores virais

Atualmente o mtodo mais utilizado para terapia gnica devido alta eficincia de transfeco. Os vrus so modificados para que fiquem deficientes em replicao e capazes de transferir seu material gentico para clulas-alvo. As famlias de vrus mais conhecidas e utilizadas em protocolos de transferncia gnica so: os retrovrus, adenovrus, vrus adeno-associado e herpes simples vrus.

Vetores virais

Vetores virais

Retrovrus

Lentivrus e oncorretrovrus fazem parte da famlia dos retrovrus.

Retrovrus so vrus de RNA fita simples, transcrito para DNA pela transcriptase reversa que o vrus carrega e integrado no genoma da clula infectada.
Os lentivrus tm a capacidade de transfectar clulas quiescentes. J os oncorretrovrus tm preferncia por clulas em diviso, como tumores . Sua propriedade de integrao ao genoma hospedeiro acentua a possibilidade de garantir a expresso estvel do transgene. No entanto, existem problemas como a integrao aleatria dos retrovrus no genoma hospedeiro podendo inserir-se no meio de outro gene modificando sua expresso naquela clula. Outro problema de grande importncia a questo de segurana na manipulao de vetores virais baseados em vrus como o HIV.

Retrovrus

Integrao cromossmica do RNA Expresso estvel e permanente Sem especificidade celular

Integrao ao acaso
Possibilidade de recombinao Ativao de oncogenes Clulas com capacidade de diviso

Adenovrus

Para transfeco eficiente in vivo foram elaborados vetores adenovirais.

Adenovrus so pequenos vrus de DNA dupla fita.


Esses vetores conseguem infectar a maioria dos tipos celulares de mamferos, alm de ser possvel purific-los em larga escala. Entretanto, o efeito citotxico nas clulas infectadas causa diminuio da expresso do transgene. Eficientes para transferncia gnica No se integram no genoma.

Adenovrus associado

O genoma do AAV contm uma fita simples de DNA. Nas clulas humanas o vrus fica latente, sua ativao ocorre na presena de um vrus auxiliador, como o adenovrus ou herpes simples vrus.
O AAV uma atraente alternativa, pois no est associado a nenhuma doena em humanos. Pode infectar grande variedade de clulas, menos imunognico e transfecta fotorreceptores com mais eficincia que os adenovrus. Os vetores AAV tm como limitaes sua difcil preparao em altos ttulos, tamanho reduzido do inserto que o vetor consegue acomodar e necessidade de co-infeco das clulas com o vrus auxiliador para facilitar a converso da simples fita de DNA em DNA dupla fita. Podem integrar o genoma aleatoriamente

Silenciamento gentico

RNAi: A NOVA FACE DA TERAPIA GNICA

Pequenas molculas de RNA so sintetizadas nas clulas, a partir do seu genoma, de modo a produzir estruturas similares a grampos, formando molculas de RNA dupla-fita (conhecidos como microRNA, ou miRNA) que controlam a expresso de genes celulares, seja a partir da degradao do RNA mensageiro, seja a partir de um bloqueio da sntese protica.

Esse sistema interfere na expresso gnica das clulas, e por isso recebeu o nome de RNA interferncia (RNAi) .
Essas molculas, conhecidas como siRNA (small interfering RNA), devem ser complementares seqncia do gene-alvo e podem reduzir a expresso deste em at 80%.

Aplicaes

Aplicaes da Terapia Gnica

Tratamento

Tratamento de doenas genticas


Na maioria das vezes o tratamento das doenas genticas somente paliativo: -aliviar a dor -melhorar a qualidade de vida

amenizando os sintomas ao invs de agir na causa primria: o gene

ESTRATGIAS DE TRATAMENTO
DOENAS MONOGNICAS -Tratamento se baseia na reposio da protena deficiente melhora do funcionamento ou minimizando as consequncias de sua deficincia -efetivo em 12% dos distrbios Quanto mais precoce o diagnstico e institudo um tratamento mais favorvel ser a evoluo dos pacientes.

DOENAS COMPLEXAS MULTIFATORIAIS

-se o fator ambiental conhecido: oportunidade efetiva de interveno modificao ou no exposio ao fator ambiental -tratamento cirrgico ou mdico

TRATAMENTO AO NVEL DO FENTIPO AFETADO


Transplante de rgo Ativao de um gene dormente Fornecimento da protena Evitar o agente danoso Remoo do produto txico acumulado Dieta especial

ADA e Talassemia: Medula ssea Talassemia Beta: Gene da cadeia da hemoglobina Hemofilia A/B: fator VIII/IX coagulao. Diabetes: insulina Xeroderma pigmentosum: luz solar D. Wilson: acmulo de cobre penicilamina e trientina Fenilcetonria: dieta baixa de fenilalanina de

DOENAS MONOGNICAS COM TERAPIA EFETIVA


Hiperplasia adrenal congnita: reposio hormonal Fenilcetonria: restrio diettica de fenilalanina Hemofilia: reposio do fator Imunodeficincia combinada grave: transplante de medula Cistinria: ingesto de lquidos: D-penicilina Agamaglobulinemia: reposio de imunoglobulinas Acidria metilmalnica: vitamina B12 Doena policstica adulta: transplante renal

DOENAS MULTIFATORIAIS COM TERAPIAS EFETIVAS


Fenda labial e palatina: cirurgia Estenose pilrica: cirurgia Cardiopatia congnita: cirurgia e medicao Hidrocefalia: cirurgia e medicao Hipertenso: medicao lcera pptica: medicao e cirurgia Epilepsia: medicao

Consequncias do tratamento das doenas genticas


Efeitos colaterais a longo prazo:

Hemofilia: infuso do fator de coagulao formao de anticorpos contra a protena Talassemia: transfuso de sangue sobrecarga de ferro

1 Passo:

Gene de interesse

Organismo-alvo

CLULAS ALVO
Caractersticas: acessveis, tempo de vida longo no corpo, alta taxa de proliferao
Tipos de clulas alvo: Clulas tronco (medula ssea- cordo umbilical) linfcitos fibroblastos de pele clulas musculares (mioblastos) clulas vasculares endoteliais hepatcitos

http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/2bachillerato/genetica/contenido14.htm

Escolha do Protocolo de Terapia Gnica

Exemplos :

Fibrose Cstica Parkinson Retinite Pigmentosa

Tratar diretamente rgo especfico

Hemofilia Doenas Metablicas

Tratar Sistemicamente Fgado e Msculo

Escolha do Protocolo de Terapia Gnica


Doenas monognicas recessivas

Expresso do gene funcional

Doenas Monognicas Dominantes

Silenciamento do gene anormal

DNA Antisense

Mas tambm podem ser tratadas:

Doenas Adquiridas: HIV, Cncer, Cardiovasculares

CASO CLNICO

Parte I: Criana com 8 meses levado a emergncia devido batida na cabea. O levantamento da histria mdica mostrou que teve vrios episdios de sangramentos nasais. O mdico suspeitou de um distrbio de coagulao e solicitou exame de triagem.

Parte II: Os resultados da triagem de coagulao mostraram a anlise de tempo de protrombina e funcionamento das plaquetas normais. Porm mostraram um tempo prolongado de protromboplastina parcial ativada, suspeitando de alterao de fator de coagulao. Os resultados mostraram que Ethan tem menos de 1% de atividade do fator IX de coagulao, consistente com diagnstico de hemofilia B.

CASO CLNICO

Parte III: Os pais foram encaminhados a um hematologista e uma equipe de gentica para explicar as caractersticas da doena (recessiva ligada ao X) e opes de tratamento.

Mutao no gene do fator VIII (Hemofilia A) ou IX (Hemofilia B) de coagulao afeta 1:5000 homens Sintomas: sangramento espontneo nas juntas, nos tecidos moles e rgos vitais Tratamento: injees regulares de fator VIII ou IX

CASO CLNICO

Parte IV: O hematologista explica sobre o tratamento usando uma infuso intravenosa de fator IX recombinante ou derivado de plasma. Devido a herana ligada ao X tambm solicita o teste gentico na criana e na me.

Mais de 2100 mutaes diferentes

Parte V: Aps 18 anos, Ethan foi internado vrias vezes. Os pais ficaram sabendo sobre a terapia gnica e procuraram o hematologista para ser includo no ensaio clnico. Neste ensaio a terapia injetada diretamente no msculo

http://maxianarellidebemcomavida.blogspot.com/2009_03_01_archive.html

CASO CLNICO

Procedimento: extrao de clulas da pele (fibroblastos) insero do gene normal em plasmdeo (no provocam rejeio pelo organismo) inseridos nos fibroblastos por choque eltrico clonagem dos fibroblastos pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem, aps pequenas incises aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes) benefcios foram temporrios: apenas 10 meses

CASO CLNICO

Parte VI: Ethan participou de um ensaio de terapia gnica usando AAV recombinante direcionado ao fgado pela veia porta. Houve um pequeno aumento nos nveis de fator IX, mas ainda no o suficiente.

Sucessos e Insucessos da Terapia Gnica - Imunodeficincia (ADA)

Lewis, R., 2004.

Sucessos e Insucessos da Terapia Gnica - Imunodificincia (ADA)

Deficincia da Adenosina Desaminase (1990) Primeira Terapia Gnica


Duas meninas uma 4 e outra de 8 anos com SCID receberam seus prprios leuccitos intravenoso aps tratamento com TG introduzido o gene normal para ADA; Nos anos seguintes elas permaneceram relativamente saudveis, mas com tratamento sendo repetido; Uma precisou de PEG-ADA (enzima sinttica) e a outra apresentou 25% de suas clulas T normais. Desde 1991: > 90 pacientes foram tratados usando clulas fronco do cordo umbilical ou medula ssea Os pacientes tm sobrevivido, a maioria sem

VTIMA DE TERAPIA GNICA

Universidade de Pensilvania: rapaz de 18 anos faleceu durante triagem de TERAPIA GNICA faleceu 4 dias aps a terapia falncia mltipla de rgos Doena: deficincia de ornitina transcarbamilase (OTC): doena ligada ao X distrbio do ciclo da uria (fgado) causa nveis imprprios de amnia no sangue Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhes de adenovrus) injeo no fgado altos nveis de IL-6 consequncias sistmicas sndrome de resposta inflamatria sistmica letal

VTIMA DE TERAPIA GNICA

Julho/2007: mulher de 36 anos com artrite reumatide faleceu 22 dias aps receber a segunda dose de um gene teraputico para artrite. Aps investigao pela FDA no foi possvel atribuir a morte da paciente a terapia

TERAPIA GNICA DO CNCER


Cerca de 650 protocolos: triagem clnica 2/3 dos protocolos de terapia gnica em estudo envolvem cnceres no herdados introduo de genes supressores de tumor para restaurar a funo perdida.

Ex.: insero do gene TP53 normal em tumores de pulmo bloquear a progresso tumoral e apoptose

Terapia Gnica no Brasil


- Em 2004 foi criada a Rede de Terapia
-

Gnica 14 grupos de pesquisa dos estados do Rio de Janeiro, So Paulo e Rio Grande do Sul, financiados pelo Institutos do Milnio do CNPq/MCT. Pesquisas: introduo de genes com efeito teraputico
Qual o alvo do Brasil? - terapia gnica em cncer - doenas graves do metabolismo - doenas degenerativas e cardiovasculares - vacinas de DNA profilticas para doenas infecciosas e vacinas de DNA teraputicas para HPV

Terapia Gnica no Brasil

Rede composta por:


Rio de Janeiro: o Instituto de Biofsica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Cncer (InCa); So Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butant; Rio Grande do Sul: os Departamentos de Gentica e de Biofsica e o Hospital de Clnicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

Vdeo

http://www.youtube.com/watch?v=Fz4egOd-VY4

Obrigada !