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Universidade Federal de Alagoas Curso de Farmcia Disciplina de Parasitologia Clnica

Janana Barros e Jordana Rodrigues

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Leishmaniose Visceral Diagnstico

A doena
Leishmaniose visceral calazar; febre negra.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Transmisso
* Provocada pelos protozorios flagelados do gnero Leihmania (L. donovani) * Transmitida atravs da picada de flebotomneos

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Reservatrio
* Ces e seres humanos

Ciclo

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Sintomas
* Homem - Febre, esplenomagalia, hepatomegalia, anemia, manifestaes hemorrgicas. * Cachorro- Fraqueza, queda de plos, vmitos, emagrecimento, sinais na pele, crescimento das unhas.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Incidncia

* Mais comum no subcontinente indiano e na frica equatorial


* Rara em Angola e Moambique

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Diagnstico
Dados epidemiolgicos; Clnicos; Laboratoriais.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Diagnstico epidemiolgico
Ocorrncia de casos caninos Presena do vetor

Nmero de casos registrados


Grau de endemia da regio

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Diagnstico clnico
Tem como base seus principais sintomas: Febre, hepatoesplenomegalia, anemia e manfestaes hemorrgicas.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Diagnstico laboratorial
Baseia-se em alteraes: -Hematolgicas -Bioqumicas -Imunolgicas
Comprovao: -Exames gerais -Testes imunolgicos -Exames parasitolgicos

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Exames gerais

Encontra-se abaixo de 10%g. Leucograma- leocopenia e neutropenia

abaixo de 150 mil/mm

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Exames Gerais
Tempo de coagulao anormal

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Exames Gerais
Alteraes hepticas

Visvel inverso da relao albumina/globulina Eletrlitos normais (em alguns pacientes, alteraes urinrias com hematria e proteinria)

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Exames Gerais
Radiografia do trax - pneumonite intersticial difusa, derrame do pericrdio com aumento da rea cardaca e elevao das cpulas diafragmticas pela hepatoesplenomegalia.
Ultra-sonografia abdominal- revelar alteraes hepticas suspeitas.

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Testes Imunolgicos
Teste de Montenegro (-) Testes sorolgicos

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Reao de imunoflueorescncia indireta (RIFI)


Mais utilizado no Brasil, pelo MS. Princpio do teste: Deteco de anticorpos contra Leishmania em soros humanos. O que ? Consiste na reao do soro com os parasitas, fixados em lminas de microscopia, em seguida, utiliza-se um conjugado fluorescente para evidenciao da reao.

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Reao de imunoflueorescncia indireta (RIFI)


* Considera-se positivo resultados a partir de 1:32 98% especificidade- promastigota 91% especificidade- amastigota * Em titulaes de 1:128, tem-se 100% de sensibilidade para as duas formas.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Teste de ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay )

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Teste de ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay )


Se baseia em reaes antgeno-anticorpo detectveis atravs de reaes enzimticas. Bastante sensvel aos antgenos utilizados; Especificidade depende do Ag empregado. Fraes de glicoprotenas: 100% sensibilidade 98% especificidade Eficcia inferior apenas aos extratos de Ag brutos.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Teste de ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay )


Como feito?
1. Preparao de um Ag aderido a um suporte slido (placa de ELISA) 2.Sobre este, colocar os soros em teste Objetivo: busca de Ac contra o Ag. Presena de Ac no soro ocasionar a formao da ligao Ac-Ag 3.Deteco da ligao Ac-Ag pela adio de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar anticorpos, qual ligada peroxidase. Este anticorpo (anti-IgG) + enzima = conjugado 4.Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima, nos orifcios onde ocorreu a reao Ac-Ag apresentar uma colorao (varivel dependendo do substrato).

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PCR (Preliminary Chain Reaction)


Biologia molecular permite a identificao do DNA do parasita PCR (Preliminary Chain Reaction) - realizado em bipsias ou em leuccitos de sangue perifrico de pacientes infectados por L. donovani.

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PCR (Preliminary Chain Reaction)


Baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo. Durante o PCR so utilizadas altas temperaturas (1 minuto a 94-96C)- separar as molculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo ento a ligao de oligonucletidos iniciadores (primers), tambm em cadeia simples e geralmente constitudos por 15 a 30 nucletidos, obtidos por sntese qumica.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

PCR (Preliminary Chain Reaction)


Para a amplificao: 2 primers Atuao nos terminais 3'- permitindo a atuao da DNA polimerase durante a sntese da cadeia complementar usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

PCR (Preliminary Chain Reaction)

Para a realizao do PCR: - pequenas quantidades do DNA alvo; - um tampo salino contendo a polimerase; - oligonucletidos iniciadores; - os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA; - cofator Mg2+.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Exames parasitolgicos
Demonstrao do parasita pode ser feita em vrios elementos do Sistema Reticuloendotelial (SER), em especial atravs de mtodos diretos ou isolamneto por cultivo.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Mtodos diretos
Sangue perifrico: amastigotas em 30% dos pacientes. Aspirado da medula: amastigotas identificadas em at 70% dos casos. Aspirado esplnico: 95% de especificidade

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Isolamento por cultivo


Os mtodos de cultivo in vitro em meios especiais podem apresentar positividade superior a 60%. Meios NNN (Novy-MacNeal-Nicolle) Promastigotas- meio NNN, LIT, Schneiderss' ou outro meio difsico. In vivo os teste so desenvolvidos em hamsters, os quais desenvolvem a doena em um perodo de 3 a 6 meses.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Introduo
* Exames parasitolgicos so considerados referncia, onde a sensibilidade da pesquisa direta em esfregaos em lmina varia de 95% a 98% para aspirado de bao, 76 a 91% para o de fgado, 52 a 89% para o de medula ssea e 52 a 69% para o de linfonodos.

* Diagnstico em cultura 80%

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana Teste
PCR RIFI ELISA DAT ELISA rk39

Sensibilidade
>90% 82 a 95% entre 90 e 100% 91 a 100% 93 a 99%

Especificidade
100% 78 a 92% 71 a 100% 72 a 100% 93 a 100%

Plataformas Imunocromatogrficas

67 a 100%

59 a 100%

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Mtodos
- Foi feito simultaneamente entre 2005 e 2007 em quatro Estados Brasileiros:

Maranho (UFMA)
Piau (UFPI) Bahia CPqGM) Minas Gerais (CPqRR)

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Mtodos
Foram avaliados 332 pacientes, onde: - 213 casos - 119 no-casos de LV

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Mtodos
A amostra foi calculada com base nos dados de um estudo-piloto realizado no CPqRR. Considerou-se sensibilidade estimada de 95%, especificidade estimada de 95%, nvel de confiana de 95% e preciso de 4%.

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana
Esplenomegalia, hepatomegalia, anemia, leucopenia; ou plaquetopenia. Imunodeficincia, uso de imunossupressores, histria pregressa de LV e a ausncia de definio de diagnstico definitivo.

Foram includos

Foram excludos

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Mtodos Casos de LV

Presena confirmada de Leishmania spp. em aspirados de medula ssea

Giemsa

Cultura NNNLIT

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Teste Imunocromatogrfico, produzido pela DIaMed AG (Cressier sur Morat, Sua)

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

* Mtodos
Foram calculadas sensibilidade, especificidade e respectivos intervalos de confiana de 95% para todos os testes estudados.

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*Resultados

213 Casos de LV 119 No-casos


57 (17,%) do CPqRR; 119 (35,8%) do CPqGM 121 (36,4%) da UFPI; 35 (10,5%) da UFMA.

Mdia de idade foi de 12,7 anos; (1 ms a 76,8 anos)


57,7% do sexo masculino; Mdia do tempo de sintomas:

- Casos: 53 dias
- No-casos: 71 dias

Leishmaniose Visceral Diagnstico

*Resultados Portadores
Emagrecimento (66,4%); Palidez (86,2%); Tosse (41,%); Diarria (22,2%); Dor Abdominal (44,8%); Ictercia (22,5%); Sangramento (23,4%)

Emagrecimento (83,3%);
Palidez (72,3%); Tosse (41,1%); Diarria (26,9%) Dor Abdominal (49,6%); Ictercia (13,7%);

Sangramento (15,1%)

No-casos

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Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Validao do teste imunocromatogrfico rpido IT-LEISH para o diagnstico da leishmaniose visceral humana

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Resultados
14 amostras apresentaram reaes falso-negativas e quatro apresentaram reaes falso-positivas.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

ndice Kappa

Para descrevermos a intensidade da concordncia entre dois ou mais juzes, ou entre dois mtodos de classificao (por ex. dois testes de diagnstico), utilizamos a medida Kappa que baseada no nmero de respostas concordantes, ou seja, no nmero de casos cujo resultado o mesmo entre os juzes.

Leishmaniose Visceral Diagnstico Valor de kappa 0 Concordncia Pobre

0,10 0,40
0,41 0,60 0,61 0,80 0,81 1,0

Fraca
Discreta Moderada Substancial

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Valor de kappa 0 0,10 0,40 0,41 0,60 0,61 0,80 0,81 1,0

Concordncia Pobre Fraca Discreta Moderada Substancial

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Discusso
O padro-ouro utilizado imperfeito e foram excludos da anlise 61 pacientes que apresentavam quadro clnico compatvel e sorologia positiva para LV, embora o resultado do seu exame parasitolgico fosse negativo;
Adequada reprodutibilidade;

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Discusso
Validou o uso do teste IT LEISH para o diagnstico visceral em beira de leito em pacientes que apresentam quadro sugestivo de LV sem infeco concomitante com HIV. IT LEISH recomendado para o diagnstico rpido de LV com devido acompanhamento.

Leishmaniose Visceral Diagnstico

Obrigada!
Artigo Disponvel em: http://scielo.iec.pa.gov.br/pdf/ess/v17n2/v17n2a0 4.pdf