Evaluacin de la va intrnseca extrnseca y comn.

Mtra. Nelly Uvalle Integrantes: Juan Carlos Cadenas Garca. Jimena Yanneth Fernndez Parrick. Desiree Hidalgo Nio. Edith Guadalupe Rodrguez Vzquez. Alexia Karime Sifuentes Villarreal.

5 B

ndice
Introduccin Va intrnseca Video procedimiento tiempo de recalcificacion Va Extrnseca Video de tiempo de protombina Va comn Conclusin

Introduccin.
Recibe este nombre debido a que antiguamente se pensaba que la sangre era capaz de coagular "intrnsecamente" por esta va sin necesidad de contar con la ayuda de factores externos. Actualmente se sabe que esto no es exactamente as. De hecho la va extrnseca es la que realmente inicia el proceso y la va intrnseca sirve de amplificacin y seguridad del proceso homeosttico. Se la llama extrnseca ya que el estmulo inicial que desencadena la cascada es extravascular, esta va requiere de factores ajenos a la sangre. Comienza cuando la sangre entra en contacto con tejidos lesionados o se mezcla con extractos de tejidos, se genera muy rpidamente factor Xa. Llegando al punto en que se activa el factor X, ambas vas confluyen en la llamada va comn. La va comn termina con la conversin de fibringeno en fibrina, y el posterior entrecruzamiento de la misma estabilizando el cogulo. .

ndice

ndice

Esta constituida por dos grupos de factores independientes: Sistema activador de contacto Factor XII Factor XI Cimgeno de alto peso molecular (HMWK) Precalicrena Factores VIII y IX
Principio general: se provee en forma artificial un mtodo para mantener constate la activacin por contacto y la participacin plaquetaria (Pf3).

Fundamento El plasma descalificado es colocado a 37C y se mide el tiempo que tarda la formacin del cogulo cuando se mezcla con una solucin de cloruro de calcio de concentracin conocida Este estudio puede hacerse en plasma rico en plaquetas y en plasma pobre en plaquetas. Cuando se utiliza el primero, el examen evala todos los aspectos de la va intrnseca, incluyendo el factor 3 plaquetario Es especialmente sensible a la inhibicin por el anticoagulante Lpico Cuando se utiliza plasma pobre en plaquetas, el tiempo de coagulacin es ms prolongado

Material
Citrato

de sodio Cloruro de calcio 0.25 M Plasma normal, muestra fresca, colectada de la misma manera que la muestra del paciente

Valores Normales
PRP

= 120 segundos a 160 segundos PPP = 160 segundos a 200 segundos

Procedimiento
1. 2. 3.

4.
5.

Colocar 0.1 ml. De plasma en un tubo de ensaye. Poner el plasma a bao mara por 1 min. Agregar 0.2 de CaCl2 inmediatamente que se coloca el CaCl2 se pone en marcha el cronometro. Agitar suavemente la mezcla y dejar reposar a 37C durante 70 seg. a partir de este tiempo inclinamos el tubo ligeramente cada 5 seg. hasta que se observa la formacin del coagulo se detiene el cronometro y se anota el tiempo transcurrido.

ndce

Fundamento El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) involucra la recalcificacin de plasma en presencia de una concentracin estandarizada de cefalina (substituto plaquetario) y un activador del factor XII (kaoln) Este proceso minimiza las variables de la prueba debido a la estandarizacin de la activacin de contacto y optimiza la concentracin de fosfolpidos El TTPa es una prueba que valora la va intrnseca de la coagulacin (factores XII, XI, IX, VIII, X, V, II y I) excepto las plaquetas

Material

Fuentes de error

Tubos

de plstico o siliconizados Reactivo de TTPa Cloruro de calcio 0.25 M Plasma normal, o plasma control normal

El

rango aceptado como normal, debe determinarse para cada tipo de reactivo La incubacin prolongada acorta el tiempo de tromboplastina parcial activado Cuando se monitorea la terapia con heparina, cualquier activacin del factor 4 plaquetario que es un potente inhibidor de la heparina, se libera si no hay una correcta centrifugacin

Procedimiento
La

sangre es colectada en una proporcin 9:1 con citrato de sodio Centrifugar 15 minutos en 2,500 rpm. El plasma puede ser mantenido en una gradilla con hielo mientras se realiza la prueba. La prueba puede ser realizada en aparatos opticos o de forma manual. Pipetear 0.1 mL del plasma del paciente y agregar 0.1 mL de reactivo de tromboplastina parcial activada, la prueba debe hacerse por duplicado incubando a 37C por 2 minutos, la incubacin no debe exceder de 5 minutos Dispare con 0.1 mL de cloruro de calcio al mismo tiempo que se echa andar el cronmetro Lo mismo se realiza para un plasma testigo o al control

Valores normales

De 28 segundos a 35 segundos, dependiendo del tipo de activador que tenga el reactivo que se est usando.

Fundamento El TTPa puede estar prolongado si hay una actividad disminuida de algn factor de la coagulacin o si se encuentra presente un anticoagulante circulante. El TTPa diferencial debe hacerse en todo paciente que tenga el TTPa prolongado, haciendo una mezcla de plasma del paciente con plasma normal v/v. Si la mezcla de los plasmas indica deficiencia de un factor el tiempo se corrige, en cambio cuando existe un anticoagulante presente el tiempo se prolonga. Se pueden hacer mezclas con plasma adsorto con sulfato de bario y con suero viejo, esto para identificar el factor deficiente.

Reactivos

Plasma adsorto con sulfato de Suero envejecido por 3 das Reactivo de TTPa Cloruro de calcio 0.025 M

bario

Se

Procedimiento

va a realizar una prueba de TTPa a cada una de las siguientes mezclas: V/V plasma normal con el plasma del paciente V/V plasma normal con plasma adsorto V/V plasma paciente con plasma adsorto V/V plasma normal con suero viejo V/V plasma paciente con suero viejo

El

plasma adsorto se prepara de la siguiente manera: a 1ml de plasma normal se le agregan 500 mg de sulfato de bario, se agita y se deja en un bao de agua por 5 minutos, centrifugar 10 minutos a 2,500 rpm y separar el sobrenadante. Repetir el procedimiento tres veces. El suero viejo se obtiene de un suero separado y refrigerado de 3 das
A cada

una de las mezclas se les realiza un tiempo de tromboplastina parcial activada. El Plasma adsorto contiene los factores I, V, VIII, XI, XII, mientras que el suero viejo contiene IX, X, XI, XII

Tiempos originales del paciente

TTPa TP

TTPa

TP

Plasma deficiente en F. V
SV

Deficienci a indicada

PA

SV

PA

A A

N N

C C

NC C

VIII XI, XIII, PRECAL. IX I V X II VII

A A A A A N

N A A A A A

C NC

C C NC NC NC

NC NC C NC C

C NC C C C

N = tiempo normal; A = Tiempo anormal; C = Correccin parcial; NC = Tiempo no corregido; = No se realiza; PA = Plasma adsorto; SV = Suero normal envejecido.

Fundamento
Este

Material
Plasma

boiensayo es a aplicado al TTPa y permite cuantificar de forma individual algunos de los factores de la coagulacin. Se utilizan plasmas deficientes en un solo factor. Estos pueden ser comerciales o se pueden preparar en el laboratorio a partir de un pool de plasmas normales los cuales deben tener el resto de los factores en exceso y constantes

paciente Plasma factor deficiente VIII, IX, XI, etc. Reactivo de TTPa Cloruro de calcio 0.025M

citratado del

Procedimiento

El procedimiento bsico es igual para todos los factores La muestra debe ser obtenida en citrato de sodio en proporcin 9:1 Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm y separar el sobrenadante, de manera ideal la centrifuga debe ser refrigerada El plasma debe ser almacenado en congelacin si no se va a trabajar de inmediato o mantener de 2C a 8 C. Esto es debido a que la labilidad de los factores se aumenta a temperatura ambiente Hay que realizar una curva de referencia para cada uno de los plasmas deficientes, esto se puede llevar a cabo con un pool de plasmas normales o con un calibrador comercial

Haga diluciones del plasma de referencia normal con solucin salina en tubos plsticos 1:10, 1:20, 1:40, y 1:80. La dilucin 1:10 representa el 100% de concentracin La dilucin 1:20 representa el 50% de concentracin La dilucin 1:40 representa el 25% de concentracin La dilucin 1:80 representa el 12.5% de concentracin La preparacin de la muestra problema y controles se lleva a cabo en una dilucin de 1:10 con solucin salina En la copilla de muestra se coloca 0.1 mL del plasma problema o de la dilucin del estndar correspondiente, se aade 0.1 mL del plasma sustrato deficiente, ms 0.1ml del reactivo de TTPa; se incuba por 3 minutos y se dispara el cronmetro al agregar 0.1 mL del cloruro de calcio. Registrar el tiempo de formacin del cogulo Los resultados de la curva se grafican en un papel semilogartmico, colocando en el eje de las X el porcentaje de actividad de factor VIII o el deficiente, y en el eje de las Y el tiempo de coagulacin en segundos. Si el nivel del factor deficiente es muy bajo (<5%) el plasma se diluye de 1:5, y el resultado se divide por 2.

Variaciones fisiolgicas.
Muchos factores pueden inducir un incremento en los niveles de un factor. Como sucede con factor VIII la terapia con anticonceptivos orales, el tratamiento con anticoagulantes orales o con corticoesteroides
La

Interpretacin
interpretacin es directa, sin embargo como en todos los procedimientos de coagulacin, se requiere un estricto control de la tcnica Otra posible complicacin es la presencia de un inhibidor en el plasma de prueba

Valores Normales
60 % a 120 % de actividad del factor determinado.

ndice

Tiempo de Protrombina
Fundamento
El

tiempo de protrombina es una medida de la coagulacin iniciada por la va extrnseca El estudio es desarrollado por la adicin de una tromboplastina completa (equivalente a la tromboplastina tisular) al plasma y aadiendo calcio Es afectado por la concentracin de los diversos factores, el fibringeno, la protrombina y los factores V, VII, y X Reactivos Citrato de sodio 3.8 % Reactivo de tromboplastina tisular Plasma control normal Plasma control anormal Cloruro de calcio 0.025 M

Procedimiento.
Recolectar

la muestra por la tcnica de la doble jeringa, vaciando la sangre en tubos de plstico o siliconizados utilizando el citrato de sodio como anticoagulante Centrifugue la sangre de 2,500 a 3,000 rpm por 10 minutos para preparar el plasma pobre en plaquetas, ste se mantiene en refrigeracin o en hielo hasta que se realice la prueba, sin no va a realizarse de inmediato se puede congelar a -20C Pipetee 0.2 mL del plasma problema e incubar 60 segundos a 37C y aadir el cloruro de calcio Registre el tiempo en segundos, por ciento de actividad, o INR.

Valores normales De 11 segundos a 13 segundos Interpretacin El TP se encontrar prolongado: Cuando exista una deficiencia de los factores I, II, VII Cuando existe hipofibrinogenemia se formara un cogulo pero el tiempo estar prolongado, cuando existe una afibrinogenemia no se formara cogulo En deficiencias mltiples como sucede en los pacientes con cirrosis heptica, deficiencia de vitamina K, cuando s esta en tratamiento de anticoagulantes orales La presencia de anticoagulantes circulantes dirigidos contra el factor V, o cuando se encuentra un anticoagulante tipo Lpico Presencia de coagulacin intravascular diseminada o de productos de degradacin del fibringeno o fibrina elevados Disproteinemias, como sucede en el mieloma mltiple

ndice ndce

INR

La estandarizacin internacional del TP (tiempo de protrombina) es la base del monitoreo para la terapia con anticoagulantes orales La Organizacin Mundial de la Salud junto con el Comit para Estandarizacin en Hematologa y el Comit Internacional en Trombosis y Hemostasis han recomendado reportar el TP de pacientes en terapia con anticoagulantes orales usando el INR en vez de reportar los segundos obtenidos directamente. Esto hace que los resultados sean independientes de la marca de reactivos o los mtodos utilizados en el ensayo El INR se basa en un rango o valor obtenido al dividir el TP del paciente por el TP de un pool de plasmas frescos normales o un plasma control normal

Los reactivos utilizados debern especificar en su literatura su ISI (ndice de Sensibilidad Internacional) que indica el grado de sensibilidad con respecto a las tromboplastinas de referencia preparadas con las normas internacionales de calidad. Debern aportar tambin una tabla o grfica que correlacione el TP en segundos con el ISI de cada lote de reactivo. El INR se determina de acuerdo a la siguiente ecuacin: IAC = TP paciente/TP testigo

En donde: IAC = rango del paciente o ndice de Anti coagulacin INR = IACISI

CONDICION Preoperatorio Preoperatorio en ciruga de cadera Prevencin de trombosis Primaria y secundaria Prevencin de trombosis con historia de 2 ms episodios Prevencin de tromboembolismo Arterial

RANGO INR 1.5 a 2.5 2a3 2a3 2.5 a 4 3 a 4.5

ndice

Fundamento El tiempo de trombina es una medida estandarizada de la conversin del fibringeno en fibrina mediante la adicin de una cantidad conocida de trombina exgena y midiendo el tiempo que tarda la formacin del cogulo. Se puede encontrar prolongado por:
Cantidad

menor de fibringeno hipofibrinogenemia Alteracin en la estructura molecular del fibringeno disfibrinogenemia La presencia de productos de degradacin del fibringeno PDF La presencia de heparina en el plasma y Por la presencia de paraprotenas en el plasma

Reactivos

Procedimiento
Colecte

Tubos

siliconizados con citrato de sodio como anticoagulante Cloruro de calcio 0.025 M Calibrador Plasma control

la sangre en proporcin 9:1 con citrato de sodio Centrifugu la sangre 10 minutos a 2,500 rpm y mantener el plasma en hielo Reconstituya los reactivos de acuerdo a las especificaciones indicadas En una cubeta del coagulmetro agregue 0.2 mL plasma problema plasma control, incube a 37C por 2 minutos y aada 0.2 del reactivo de trombina Registre el tiempo en segundos

Valores Normales Causas de error

De 18 segundos a 22 segundos.

Muestras

parcialmente coaguladas Trazas de heparina Trombina almacenada en contenedores de vidrio no siliconizado.

Los mtodos disponibles para el ensayo del fibringeno derivan en general de dos tcnicas diferentes:

La determinacin de un tiempo de coagulacin.

La cuantificacin de la protena coagulable.

Fundamento

En este mtodo el fibringeno se mide utilizando un plasma diluido (1:10) al cual se le agrega un exceso de trombina (100 U/mL) y se mide el tiempo de la formacin del cogulo. Tanto la dilucin como el exceso de trombina sobrepasan la influencia de los inhibidores. Est mtodo es satisfactorio para ser usado en urgencias hemorrgicas y puede ser realizado rpidamente.

Reactivos. v
Tubos

siliconizados con citrato de sodio al 3.8% como anticoagulante Solucin salina Solucin de trombina. Se puede hacer una solucin patrn aadiendo 100 mL de solucin salina a un vial que contenga 1000 U de trombina bovina, dando una concentracin final de 100 U/mL Una mezcla de plasmas normales, o plasma de referencia comercial de concentracin conocida de fibringeno Equipo para la determinacin de fibringeno Coagulmetro o equipo automatizado Papel logartmico de 2 ciclos en caso de que el coagulmetro no tenga la curva integrada

La sangre debe ser colectada mediante la tcnica de doble jeringa, y vaciar en tubos siliconizados con citrato de sodio en proporcin 9:1, centrifugue inmediatamente durante 5 minutos a 3,000 rpm. Reconstituya los reactivos comerciales como lo indican los insertos. Prepare la solucin de trabajo en caso de que se tenga trombina concentrada, o si tiene el equipo de fibringeno, seguir las instrucciones para reconstituir el reactivo de trombina que ya viene lista la solucin de trabajo. Los reactivos son estables entre 2C y 8C hasta la fecha de caducidad. Usando la solucin salina prepare diluciones 1:5, 1:15, 1:40 del estndar de plasma de concentracin conocida de fibringeno.

Determine el tiempo de coagulacin de cada dilucin por duplicado, incubando 0.2 ml de plasma diluido en un bao de agua a 37oC por 3 minutos antes de aadir 0.1 ml de la solucin de trombina que estar a temperatura de 37oC. Esto se hace por duplicado Promedie el tiempo de coagulacin de cada dilucin y grafique los puntos en el papel logartmico. El tiempo de coagulacin en segundos debe graficarse sobe las ordenadas y la concentracin de fibringeno sobre las abscisas Realice una dilucin 1:10 de la muestra del paciente con solucin salina y prubela por duplicado. Niveles muy altos requieren una dilucin 1:20 y valores muy bajos una dilucin 1:5 1:2 El reporte se hace en mg/100dL. De manera ideal debern llevar control normal y anormal.

Valores Normales
De 170 mg/dL a 410 mg/dL, con un valor medio de 290 mg/dL

Fundamento

Las protenas del plasma tienen diferente solubilidad en diferentes soluciones. El reactivo de parfenjev precipita el fibringeno pero deja en solucin las dems protenas. El grado de turbidez est en relacin con la concentracin de fibringeno. Esta es una prueba precisa pero puede encontrar cambios significativos en la concentracin de la protena.

Reactivos
Citrato de sodio (0.1 M) Solucin de cloruro de sodio, NaCl (0.85%) Reactivo de Parfenjev: Sulfato de amonio (NH4)2 SO4, 133.33g. Cloruro de Sodio (NaCl), 10 g. Agua destilada, 1000 mL. Ajuste el pH a 7.00 con hidrxido de sodio (NaOH), 10 M.

Procedimiento
Tomar la muestra con la tcnica de la doble jeringa y vaciar en tubos siliconizados con citrato de sodio en proporcin 9:1 Centrifugue la sangre a 3,000 rpm por 10 minutos. Separe el plasma y mantenga a temperatura de 4oC Marque dos cubetas del espectrofotmetro, una como B (blanco) y la otra como P (problema) Ponga en el tubo B, 0.5 mL de plasma y 4.5 mL de solucin de cloruro de sodio Lea en un espectrofotmetro, a una longitud de onda de 510 nm. Se coloca el blanco y se calibra a 100% de transmitancia o a 0 de densidad ptica

En el tubo marcado P coloque 0.5 ml de plasma y agregue 4.5 ml de reactivo de parfenjev. Mezcle por inversin lenta, deje reposar exactamente 3 minutos y lea la densidad ptica La concentracin de fibringeno se obtiene por la siguiente ecuacin:

Fibringeno (mg/dL) = D.O.P. (D.O. problema) + 0.019 X1000 0.509

Valores Normales

Varan de 200 mg/dL a 400 mg/dL.

Conclusin.

En estos temas realizamos diversas pruebas para ver los tiempos de coagulacin en la sangre. Primero investigamos sobre las 3 vas de la fibrinlisis para poder realizar las practicas (va intrnseca, extrnseca y comn).

ndice