UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

Departamento de Fisiologa y Farmacologa

Laboratorio de Farmacognosia y Farmacologa

Interacciones frmaco-receptor Curvas dosis-respuesta

Complejo F-R

FRMACO

RESPUESTA
SITIO DE UNIN

RECEPTORES FARMACOLGICOS

Enlaces electrostticos, fuertes o dbiles pero normalmente reversibles

Unin por enlaces covalentes son estables y esencialmente irreversibles

Cmo actan los frmacos en el organismo?

FRMACO

inicia una serie de modificaciones bioqumicas y fisiolgicas

RECEPTORES FARMACOLGICOS

RESPUESTA

El frmaco no origina mecanismos o reacciones nuevas, sino que se limita a estimular o inhibir los procesos propios de la clula
El conocimiento de la naturaleza de estos sitios de unin, y los mecanismos por los que esta unin origina una respuesta, es la base principal de la investigacin en Farmacologa

Receptor farmacolgico = diana

Un componente macromolecular de una clula con la cul interacciona un frmaco para producir una respuesta

ADN

Tubulina

Protenas
1. Enzimas 2. Canales inicos 3. Molculas transportadoras 4. Receptores

Protenas plasmticas
RECEPTORES SILENCIOSOS = ACEPTORES

IUPHAR (Unin Internacional de Farmacologa) RECEPTOR : macromolcula celular implicada en los procesos de transmisin de seal, con la que interactan neurotransmisores, frmacos o mediadores para inducir una modificacin funcional

Dinmica de activacin de un receptor

Neurotransmisor Hormona
Receptor Clula endotelial Clula msculo liso xido ntrico

Transduccin
Arteria contrada

(Accin)
modificaciones celulares y moleculares desencadenadas por la interaccin entre ambas molculas

Reconocimiento
asociacin especfica entre el ligando y su receptor:
Clula msculo liso contrada

Respuesta funcional
Vasodilatacin

(Efecto)
consecuencia final del proceso

Interaccin frmaco-receptor

Teora ocupacional Clark ,1933 F+R Complejo F-R Respuesta

Asume que la respuesta de un tejido a un frmaco es debida a la ocupacin de los receptores por las molculas del frmaco

a) La unin frmaco-receptor es reversible. b) Existe una relacin lineal entre el nmero de receptores ocupados y la respuesta farmacolgica. c) La respuesta mxima aparece con la ocupacin de todos los receptores.

Interaccin frmaco-receptor

[F] + [R]
En equilibrio:

k1 k-1

[F-R]

k-1/k1 = constante de disociacion (kd)

[F] x [R] x k1 = [FR] x k-1

k1/k-1 = 1/kd

= constante

afinidad

[F] [R]
[F-R]

= kd

A menor kd el frmaco es ms potente

Afinidad: Es la capacidad del frmaco para unirse

a un receptor especfico y formar el complejo F-R.

Interaccin frmaco-receptor

[F] + [R]
[F] . [R]
[F-R]

k1 k-1

[F-R]

Efecto

= kd

[RT] = [RL] + [F-R] [F]. ([RT] -[F-R])

[F-R] = kd

[RT] . [F] [F-R] = -------------kd + [F]

El efecto farmacolgico es proporcional a la concentracin de complejos [F-R]

[RT] . [F] [F-R] = -------------kd + [F]

[F-R] [F] -------- = ---------[RT] kd + [F]

0.5

[F]

Log [F]

% fall in blood pressure

50

% fall in blood pressure

40 30 20 10 0 0.1 0.31 3
Control L-NAME

Escala aritmtica 40
[RT] . [F] 20 [F-R] = -------------Control 10 kd + [F]L-NAME
30 0 -2 -1 0[F] 1 [F-R] 0.1 0.3 1 r = -------- = --------- 3 Acetylcholine nmol/kg [RT] kd + [F] 2
10

50

10

Acetylcholine nmol/kg

Velocidad de cambio es rpida al principio y se hace progresivamente ms pequea cuando la dosis se incrementa Cuando incrementos en la dosis no producen cambios en el efecto hemos obtenido el efecto mximo

Dificultad para el anlisis matemtico

% fall in blood pressure

50 40 30 20 10 0 -2 -1
0.1 0.3 Control L-NAME

Escala logartmica
[RT] . [F] [F-R] = -------------kd + [F]
2
10

0
1

1
3

Acetylcholine nmol/kg

[F-R] [F] r = -------- = --------[RT] kd + [F]

Transformacin de una curva hiperblica en sigmoidea Parte central es una lnea recta Se comprime la escala de la dosis Dosis proporcionales aparecen a intervalos iguales Ms fcil para el anlisis matemtico

[RT] . [F] [F-R] = -------------kd + [F]

Cuando F-R = 50% F-R Entonces receptores ocupados = RT / 2

[RT] [RT] . [F50] -------- = -------------2 kd + [F50]

(kd + [F50]) . [RT] = 2 . [RT] . [F50] kd + [F50) = 2 [F50]

kd = [F50]
A igual grado de ocupacin todos los agonistas producen el mismo efecto Solo se distinguen dos tipos de frmacos: los agonistas, y los antagonistas

Frmacos agonistas
Frmaco que interacciona con el receptor y lo activa Tiene afinidad y actividad

Frmacos antagonistas
Frmaco que interacciona con el receptor pero NO lo activa Tiene afinidad pero NO actividad

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Potencia
Frmaco A Frmaco B Frmaco C Frmaco D -7,0 -5,0 -3,0

-9,0

[F50]

Posicin relativa de las curvas dosis-respuesta en el eje de abcisas Tiene poca significancia clnica para un efecto teraputico dado. Un frmaco ms potente que otro no significa que clnicamente sea superior La potencia baja es una desventaja slamente si la dosis es tan grande que es un problema administrarla.

Interaccin frmaco-receptor

Teora de Ariens (1964)

[RT] . [F] [F-R] = -------------kd + [F]

-10

-8

-6

-4

-2

Log (M)

Actividad intrnseca () capacidad de los frmacos

de generar un efecto tras interaccionar con un receptor EF = [F-R]

[RT] . [F] [EF] = ---------------kd + [F]

Emax = [RT]

Emax . [F] EF = ---------------kd + [F]

Interaccin frmaco-receptor

Emax . [F] EF = ---------------kd + [F] E50 = Emax /2

Emax . [F50] E50 = ---------------kd + [F50]

Emax Emax . [F50] ------ = ---------------2 120 kd + [F50]

100

Respuesta (%)

Emax (kd + [F50]) = 2 Emax . [F50] kd + [F50] = 2 [F50]

80 60 40 20 0

kd = [F50]

-9

-7

-5

-3

Log (M)

Constante de disociacin : concentracin del agonista que produce el 50% de la respuesta mxima
120

kd = [F50]
Respuesta (%)

100 80 60 40 20 0

- Log kd = - Log [F50]

Logaritmo negativo en base 10 de la concentracin de un agonista que produce el 50% de la respuesta mxima

-9

-7

-5

-3

Log (M)

p[F50]

pCE50
pD2

Cuanto mayor es pCE50 mayor es la potencia del agonista

Interaccin frmaco-receptor

La actividad intrnseca se expresa en unidades arbitrarias, mediante el cociente entre el efecto mximo que se obtiene y el efecto mximo con el que responde el sistema biolgico agonista perfecto: = Emax / EMAX
120 100

=1

Agonista total = 1

Respuesta (%)

80 60 40 20 0 -9 -8 -7 -6

= 0.7
Agonista parcial 0<<1 = 0.3 Antagonista = 0
-5

(Log M)

Frmacos agonistas
Interaccionan con receptores y los activan. Tienen afinidad y actividad Completo: un agonista con la mxima actividad intrnseca Parcial: un agonista con menos de la mxima actividad intrnseca

Frmacos antagonistas
Interaccionan con los receptores pero NO los modifican. Tienen afinidad pero NO actividad

Interaccin frmaco-receptor

Emax . [F] EF = ---------------kd + [F]

1 kd + [F] kd 1 1 --- = ----------------- = ------- . ---- + -----EF Emax . [F] Emax [F] Emax
y = a x +b

Representacin de Doble recproco

Interaccin frmaco-receptor

[RT] . [F] [F-R] = -------------kd + [F]

Teora de Stephenson (1956)

1.- La respuesta es una funcin desconocida de la ocupacin de los receptores 2.- El efecto mximo se puede producir con una ocupacin pequea de receptores. 3.- Los frmacos pueden tener diferentes capacidades para iniciar una respuesta

Eficacia (e) : capacidad de generar estmulos

Se pueden obtener respuestas iguales por distintos frmacos con ocupaciones diferentes de receptores

Interaccin frmaco-receptor

Teora de Stephenson (1956)

EF R = ------- = (S) Emax
[F-R] [F] -------- = ---------[RT] kd + [F]

: funcin desconocida que establece la proporcionalidad

entre el estmulo al receptor y la respuesta del tejido

e [F-R] S = -------[RT]

EF e [F] ---- = ----------Emax kd + [F]

Elimina la necesidad de asumir que la respuesta mxima de un tejido requiera la ocupacin total de los receptores por el agonista Explica la actividad de agonistas, agonistas parciales y antagonistas competitivos, Explica los cambios en la localizacin de las curvas concentracin-respuesta a lo largo del eje de las concentraciones (potencia), as como las respuestas mximas.

Interaccin frmaco-receptor

Nickerson (1956)
120 100

Experimentos en tiras de ileon de cobaya Histamina produce contraccin.

Respuesta (%)

80 60 40 20 0

En presencia de un antagonista irreversible (GD-121), las curvas se desplazaban hacia la derecha sin cambios en la pendiente ni en la respuesta mxima. Concentraciones ms altas del GD-121 reducan la respuesta mxima de histamina.
-9 -7 -5 -3

Log (M)

Las evidencias experimentales sugeran que 1% de receptores necesitaban estimularse por la histamina para conseguir la respuesta mxima.

RECEPTORES DE RESERVA

Interaccin frmaco-receptor

PORQU HAY RECEPTORES DE RESERVA?

1. Permite respuesta mxima sin la ocupacin total de los receptores. Incrementa la sensibilidad del sistema 2. Los receptores de reserva pueden unir (e internalizarse) ligando extra para prevenir una respuesta exagerada si hay demasiado ligando presente
Respuesta Ocupacin

Teora anteriores asumen que todos los receptores deberan estar ocupados para producir una respuesta mxima. En ese caso la mitad del efecto mximo CE50=Kd. A veces, el efecto mximo se consigue con una ocupacin parcial de receptores.

Interaccin frmaco-receptor

Stephenson
(1956)

EF e [F] ---- = ----------Emax kd + [F]

Furchgott
(1966)

e = -----[RT]

Eficacia intrnseca () = capacidad de un

frmaco para iniciar un estmulo de un receptor
Con este cambio, la capacidad de generar estmulos constituye un trmino estrictamente relacionado con el frmaco La eficacia (e) del modelo de Stephenson es un trmino dependiente del tejido y del frmaco, ya que se pueden tener eficacias diferentes en distintos tejidos.

EF ------ = Emax

[RT] [F] -------------kd + [F]

Interaccin frmaco-receptor

Respuesta

Ocupacin

Log (Agonista)

Distinguir entre ocupacin de un receptor por un agonista y la activacin de ese receptor, distincin no era considerada en los primeros trabajos sobre receptores. Explica cmo las diferencias en la funcin de transduccin y la densidad de los receptores en diferentes tejidos pueden incidir en el mismo agonista

Interaccin frmaco-receptor

MEDIDA DIRECTA DE LA UNIN F-R

ENSAYOS DE UNIN DE RADIOLIGANDOS estudios de binding

Requisitos
La unin del radioligando debe ser un proceso saturable La afinidad del radioligando debe ser elevada

La unin debe ser reversible

Competencia de agonistas/antagonistas con el radioligando

Interaccin frmaco-receptor

FACTORES A CONSIDERAR EN EL DISEO DE EXPERIMENTOS DE BINDING

1. Identificar un ligando radioactivo apropiado para el experimento 2. Utilizar un tejido adecuado para el experimento 3. Seleccionar un mtodo de separacin para separar la fraccin unida de la libre 4. Identificar un mtodo para diferenciar la unin especfica de la no especfica 5. Condiciones apropiadas para el ensayo: a. pH del buffer b. Buffers utilizado c. Reactivos adicionales para el binding d. Temperatura de la reaccin de binding

Interaccin frmaco-receptor

Eleccin del radioligando

Tipo de istopo Afinidad
El radioligando debera ser qumicamente estable en el medio y durante la reaccin de binding El radioligando debera ser puro

El radioligando debera tener alta afinidad por el receptor

La especificidad del radioligando debera ser bastante alta para detectar receptores en el tejido estudiado. Esto normalmente quiere decir una radioactividad especfica de 30 Ci/mmol o mayor El radioligando debera tener un alto grado de selectividad por el receptor que se estudia

Especificidad

Selectividad

Interaccin frmaco-receptor

Preparacin del tejido

1. Membranas celulares aisladas de clulas de cultivos 2. Membranas celulares de tejidos de rganos que han sido lavadas varias veces para eliminar cualquier ligando endgeno 3. Clulas intactas de cultivos celulares 4. Cortes histolgicos de rganos (p.e. cerebro) para estudios de binding en autorradiografa 5. Receptores solubles que estn presentes en tejidos o receptores de membranas que se han solubilizado

Interaccin frmaco-receptor

TIPOS DE ENSAYOS
1.- Determinacin de la unin especfica y no especfica 2.- Experimentos de saturacin: determinacin de Bmax y Kd 3.- Experimentos de competicin: determinacin de Ki 4.- Experimentos de cintica

1.- Unin especfica y no especfica

Incubacin del tejido con concentraciones crecientes del frmaco radiactivo

UNIN TOTAL
Repetir el experimento en presencia de una concentracin saturante de ligando no radiactivo:

UNIN NO ESPECFICA

Determinacin de la unin especfica y no especfica

UNIN ESPECFICA = UNIN TOTAL - UNIN NO ESPECFICA

2.- Experimentos de saturacin

Sirven para el clculo de la densidad de receptores (Bmax) y la constante de disociacin (Kd)

Bmax

significa todos los receptores que estn ocupados por el radioligando Es la unin total.

Kd es la concentracin de
radioligando necesaria para unirse al 50% de los receptores

2.- Experimentos de saturacin

[RL]. [F] [F-R] = ------------Kd

[B] = [F-R]
Radioligando unido (pM)

=cantidad unida

[Bmax] = RT
= n total de sitios de unin (pmol/mg protena)

[Bmax-B]. [F] [B] = ------------------Kd

Radioligando libre (M)

Interaccin frmaco-receptor

[Bmax-B]. [F] [B] = ---------------Kd

[B] -B Bmax ----- = ------ + --------[F] Kd Kd

Ecuacin para la representacin de Scatchard

[B] -1 Bmax ----- = ------ [B] + --------[F] Kd Kd

3.-Experimentos de competicin (inhibicin)

Miden la capacidad de una sustancia no marcada para competir con el radioligando Sirven para el clculo de la constante de inhibicin (Ki)

La unin se mide en presencia de una concentracin muy alta de radioligando para ocupar todos los receptores. Curvas de saturacin

La unin tambin se mide en presencia de la misma concentracin de radioligando ms concentraciones crecientes de ligando no marcado

4.- Experimentos cinticos de asociacin y disociacin

La concentracin de receptores se mantiene constante y la fijacin se determina en funcin del tiempo
Radioligando unido (cpm)

Estado de equilibrio

Tiempo (minutos) Estos experimentos permiten: - Determinar el tiempo al cual se alcanza el estado de equilibrio, para utilizarlo como tiempo de incubacin en los experimentos de saturacin y competicin. - La determinacin de K+1. Junto con la K-1 estimada en los estudios de disociacin, permiten determinar la Kd.

Interaccin frmaco-receptor

Frmacos antagonistas
Interaccionan con los receptores pero NO los modifican. Tienen afinidad pero NO actividad Dos tipos
Competitivos No competitivos

Interaccin frmaco-receptor

Antagonismo Competitivo
Compite con el agonista por el receptor Remontable aumentando la concentracin del agonista Desplaza las curvas concentracin respuesta del agonista hacia la derecha Reduce la afinidad del agonista., incrementa 1/Ke (constante de disociacin
110 90

% Contraccin

70 50 30 10 -10 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

ACh ACh +A 10-8 ACh +A 10-7 ACh +A 3x10-7

Acetilcolina (Log M)

Interaccin frmaco-receptor

ANTAGONISMO COMPETITIVO Reversible

NA NA + Propranolol

NA

NA + Fenoxibenzamina

Irreversible
Fenoxibenzamina

Interaccin frmaco-receptor

ANTAGONISMO COMPETITIVO

Reversible

Irreversible % Respuesta

% Respuesta

B =0

B =10
B =100

B=0 B=10 B=100

Log (A)

Log (A)

Interaccin frmaco-receptor

Antagonismo no competitivo
El frmaco se une al receptor y permanece unido Es irreversible Cuanto ms receptores se ocupan (esencialmente se inactivan) el agonista es incapaz de alcanzar el efecto mximo No modifica la afinidad del agonista

Interaccin frmaco-receptor

ANTAGONISMO NO COMPETITIVO
B =0

% Respuesta

B =10

Emax
= Kd

B =100

Log (A)

Clculo de la potencia de un antagonista

[A] + [R]

k1A

[A-R]

[B] + [R]

k1B

[B-R]

k-1A
En equilibrio:

k-1B
[RT] = [R] + [R-A] + [R-B]

[A] x [R] x k1A = [R-A] x k-1A

[B] x [R] x k1B = [R-B] x k-1B

[R] = [RT] - [R-A] - [R-B]

[A] x ([RT] - [A-R] - [B-R]) x k1A = [A-R] x k-1A [R-B] [R-A] -------- = 1 + ------[RT] [RT] [kA] (1 + ------- ) [A]

Interaccin frmaco-receptor

kB [R-A] kA kB ------- = ------- (1 + ------- ) (1 + ---- ) -1 [B] [RT] [A] [B]

[R-A] [A] -------- = ------------[RT] [A] + kA

[R-A] [A] -------- = ----------------------------[RT] [A] + kA (1+ [B]/kB)

[R-A] [A] -------- = -------------------------------[RT] [A] + kA (1+ [B]/kB)

Gaddum

Schild (1947) simplific la ecuacin de Gaddum de la siguiente manera:

[A] [A] ------------ = ------------------------[A] + kA [A] + kA (1+ [B]/kB) [A] kA ----- = ------ (1+ [B]/kB) [A] kA [A] [A] [A] [A] ----- +----- = ------- +---------------[A] kA [A] kA (1+ [B]/kB)

[A] [B] ------ = 1 + -------[A] kB

CLCULO DEL pA2

[A] [B] ------ = 1 + -------[A] kB

Representacin de Schild
[A] [B] ------ -1 = -----[A] kB

log ([A]/[A] -1) = log B- log KB log B = log KB

-9 -8 -7 -6 -5

Log B

pA2 = - Log B

Representando en abscisas log B y en ordenadas log ([A']/[A] -1), se obtiene una lnea recta de pendiente 1 y la interseccin con el eje de abscisas es = log KB por tanto podemos determinar la constante de afinidad (1/KB) del antagonista competitivo.

Interaccin frmaco-receptor

CLCULO DEL pD2 PARA ANTAGONISTAS

% Respuesta
0,5

NO COMPETITIVOS

B =0 B =10

log (X-1)

0 -8 -0,5 -1 -7 -6 -5 -4

B =100
Log (A)

-1,5

-2

Papaverina (Log M)

pD2 =-Log B

log ([Emax]/[E'max] -1) = log B- log KB

La medida prctica del antagonismo no competitivo se efecta determinando el pD'2 que es el logaritmo cambiado de signo de la concentracin molar del antagonista que reduce al 50% el efecto del agonista.

Interaccin frmaco-receptor

Curvas Dosis-respuesta
Graduales respuesta medida en una escala continua Cuantales respuesta del todo o nada
Relaciona dosis y frecuencia de respuesta en una poblacin de individuos A menudo derivadas de frecuencia de distribucin de dosis requerida para producir un efecto especfico

Interaccin frmaco-receptor

Curvas dosis-respuesta cuantal

(respuestas de s/no)

Curvas dosis-frecuencia

Interaccin frmaco-receptor

Cuantificacin de la seguridad
ndice Teraputico =
Porcentaje de respuesta
100

DL50

DE50
sueo muerte

sueo

100

muerte

50

50

0 DE50 DL50

0 DE50 DL50

Interaccin frmaco-receptor

Cuantificacin de la seguridad
ndice Teraputico =
DL50

DE50

Cuanto ms alto es el IT mejor es el frmaco

El IT varia de: 1.0 (algunos frmacos para el cncer ) a: >1000 (penicilina)

Frmacos que actan sobre el mismo receptor o sistema enzimtico a menudo tienen el mismo IT