Inmovilizacin de enzimas

Inmovilizacin de enzimas

Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella fsica/qumicamente asociada a, o contenida en, un soporte/matriz no esencial para su actividad. La inmovilizacin permite la utilizacin de las enzimas en procesos continuos, lo que permite aumentar su productividad, bien para facilitar la separacin del catalizador de sus productos, simplificando la etapa posterior de purificacin.

Inmovilizacin de enzimas

Inmovilizacin de enzimas

La utilizacin de enzimas inmovilizadas o no depender de una evaluacin econmica de las alternativas, donde se considerarn datos de cintica y estabilidad, costo, propiedades fisicoqumicas, eficiencia de inmovilizacin y carga del soporte. Se torna evidente que si el costo de una enzima es muy bajo, la factibilidad de su utilizacin en forma inmovilizada es poco probable.

Inmovilizacin de enzimas

Ejemplos de enzimas inmovilizadas

Soportes
Un soporte para inmovilizacin debe tener las siguientes propiedades: Elevada resistencia mecnica, qumica y biolgica Insolubilidad Hidrofilicidad Elevada razn rea/volumen Regenerabilidad Bajo costo Por regla, no todas estas propiedades estn simultneamente presentes en un determinado soporte: necesario evaluar todas las alternativas.

Soportes
Los soportes orgnicos presentan: Buena relacin rea/volumen Muy flexibles en su configuracin Bajo costo en algunos casos (residuos orgnicos) Los soportes inorgnicos a su vez presentan: Mayor resistencia Mayor regenerabilidad Propiedades fsicas (ej. porosidad) controlables

Sistemas de inmovilizacin

Las enzimas normalmente se inmovilizan a travs de algn tipo de interaccin entre sus residuos aminoacdicos y el soporte. Esto puede producir perdidas considerables de actividad, al comprometer los aminocidos en el, o vecinos del, sitio activo. Para minimizar este problema se inmoviliza por intermedio de las molculas de carbohidratos (enzimas glicoproteicas) o por la utilizacin de espaciadores.

Sistemas de inmovilizacin

Los mtodos de inmovilizacin se pueden dividir en:

Sistemas de inmovilizacin - Adsorcin

Este un mtodo simple de inmovilizacin, en el que el soporte es mezclado con las enzimas, en condiciones apropiadas de pH y fuerza inica, dejados en contacto por un determinado periodo y despus lavado para remover la protena no adsorbida. Este mtodo permite valores elevados de carga enzimtica (hasta 1 gramo de enzima por gramo de soporte). Las interacciones implicadas son resultantes de fuerzas de van der Waals, efectos hidrofbicos y de carga inica

Sistemas de inmovilizacin - Adsorcin

La seleccin del soporte pasa por su capacidad de retener la enzima, sin dejar desorber nuevamente al seno del liquido, actividad enzimtica obtenida, posibilidad de regeneracin y costo. Como ejemplos de soporte tenemos materias orgnicas neutras (carbn activo y celulosa) y cargadas (quitina, intercambiadores aninicos y catinicos), adems de materia inorgnica (bentonita, almina, vidrio y slica porosa).

Sistemas de inmovilizacin - Adsorcin

Ejemplo: preparacin de invertasa inmovilizada

Soporte
DEAE-Sephadex (intercambiador aninico) CM-Sephadex (intercambiador catinico)

pH 2.5

100 75

pH 4.7 100

pH 7.0 100

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Sistemas de inmovilizacin Enlace Covalente

La unin covalente se produce entre grupos funcionales del soporte y determinados grupos en los residuos aminoacdicos de la molcula enzimtica. Estos grupos son reactivos segn la siguiente orden:
-S- > -SH > -O- > -NH2 > -COO- > -OH >> -NH3+

La reacciones qumicas que se pueden utilizar incluyen la acilacin, la alquilacin, la diazotacin, la disulfuracin y la activacin a travs de sales de metales de transicin.

Sistemas de inmovilizacin Enlace Covalente

Ejemplo de qumicos son la carbodiimida y el glutaraldedo. Este ultimo es ampliamente utilizado para, adems de inmovilizar enzimas a soportes, hacer el entrecruzamiento entre las enzimas mezcladas con otras protenas inertes, hasta se producir agregados insolubles de tamao considerable. Se puede combinar la adsorcin con la formacin de enlaces covalente, con lo que se obtiene un aumento sustancial de la estabilidad del catalizador.

Sistemas de inmovilizacin Enlace Covalente

Como ejemplo tenemos la inmovilizacin de invertasa en quitina de camarn:

Sistemas de inmovilizacin Inclusin en matrices

En este mtodo, la enzima es contenida entre las cadenas de una red polimrica, lo suficientemente compacta para retener la enzima, pero capaz de permitir el libre flujo de reactantes. Esto tiene la implicacin que solo es til este tipo de inmovilizacin cuando se pretende procesar sustratos y productos de muy bajo peso molecular.

Sistemas de inmovilizacin Inclusin en matrices

Este mtodo es ms adecuado para inmovilizar clulas, donde el alginato de calcio es ampliamente utilizado. Otros ejemplos de matrices son los geles de poliacrilamida y el almidn. Estos presentan las desventajas de: ser no regenerables, una baja estabilidad, tener pobres propiedades mecnicas y severas restricciones difusionales.

Sistemas de inmovilizacin Retencin por membranas

En este tipo de sistemas la enzimas permanece libre el solucin, separada del medio de reaccin por una membrana protectora que solo permite el libre paso de los reactantes (sustrato/producto). Como ejemplo, tenemos las membranas de ultrafiltracin y dilisis. Otro mtodo consiste en la microencapsulacin, en la cual se produce una reaccin de polimerizacin en la superficie de las gotas de solucin enzimtica, dispersas en un solvente inmiscibles con agua, que produce una delgada pelcula (nylon), casi sin restricciones difusionales.

Principales caractersticas de los mtodos de inmovilizacin:

Caractersticas

Adsorcin
Simples bajo variable si amplia

Enlace covalente
dificil elevado fuerte no selectiva

Inclusin en matrices
dificil moderado flaca si amplia

Retencin por Membranas Simples elevado fuerte no Muy amplia

Preparacin Costo Fuerza de ligacin Liberacin de enzima Aplicabilidad

Problemas en la utilizacin
Efectos de la matriz Restricciones difucionales

elevados
si no

bajos
si no

elevados
si si

elevados
no si

Proteccin microbiana

no

no

si

si

Parmetros de inmovilizacin

Hay dos parmetros a considerar en la inmovilizacin: el rendimiento de inmovilizacin y la capacidad de carga del soporte. El rendimiento de inmovilizacin (RI) es dada por:

Algunos autores usan:

Parmetros de inmovilizacin

Ejemplo del rendimiento inmovilizacin (%) glucoamilasa:

de de

Parmetros de inmovilizacin

La capacidad de carga (CC) del soporte se define como la actividad cargada expresada en el catalizador (EI) por unidad de peso seco del soporte (W), lo que viene dada por:

Ambos los parmetros, EI y CC, estn frecuentemente en compromiso, es decir, para aumentar la CC se tiene que sacrificar el EI y viceversa.