Você está na página 1de 87

Anlise Instrumental Avanada

Espectroscopia de Infravermelho Espectrometria de Massas Profa. Dra. Sonia A. Andrade Chudzinski Prof. Dr. Erick Polleti

Espectroscopia de Infravermelho e Espectrometria de Massa


Objetivos: Ensaio de composio Qualidade do produto final Pesquisa e desenvolvimento de novos produtos Instrumentao

Contedo Programtico - IV
Introduo tcnica/aplicaes Teoria da espectrometria de absoro na regio do Infravermelho. Modos de vibrao e deformao Interaes acopladas. Ligao de hidrognio. Instrumentao Preparao de amostras. Interpretao de espectros.

Contedo Programtico - MS
Espectroscopia de massas/Aplicao Introduo tcnica. Teoria da espectrometria de massas. O espectro de massa e interferncias Determinao da frmula molecular. Reconhecimento de picos. Padres de fragmentao Preparao de amostras. Interpretao de espectros.

Metodologia

Aulas expositivas. Estudo de artigos cientficos que utilizam as tcnicas estudadas. Interpretao de espectros. Resoluo de problemas. Visita a um laboratrio de Pesquisa nessas reas.

Cronograma
13/08 - Princpios e Aplicaes de MS 20/08 Aula Prtica MS 27/08 - Princpios e Aplicaes/Exerccios sobre MS 03/09 -Princpios e Aplicaes de IR 10/09 Prtica IR 17/09 -Princpios e Aplicaes/Exerccios sobre IR 24/09 -Avaliao Terica/prtica 01/10 -Resultados Avaliao e Reviso/Discusso de artigos

Espectrometria de Massa

Tcnica analtica, utilizada para identificar e quantificar compostos conhecidos e elucidar a estrutura e a propriedade qumica de molculas

Aplicaes:
Detectar e identificar o uso de substancias por atletas Anlises judiciais (abuso de drogas) Determinar como as drogas so metabolizadas pelo corpo Monitorar a respirao de pacientes por anestesistas durante a cirurgia Diagnstico de Cancer o outras doenas Biotecnologia: Proteomica Monitorar processos industriais Anlise de poluentes

Espectrometro de massas um instrumento que separa ons, positivos ou negativos, produzidos a partir de tomos ou molculas de acordo com a razo massa/carga (m/q)

Mecanismo
Vaporizao da amostra (amostras volteis/termolbeis)

Ionizao da fase gasosa (bombardeamento com feixe de eltrons) Ex: C6H5CH2CH3 + e- C6H5CH2CH3+ + 2 e- (etilbenzeno) (on molecular)
Relaxao/fragmentao C6H5CH2+ / atrados por uma fenda/selecionados Separao dos ons de acordo com massa/carga(m/z)

Espectro de massa - Etilbenzeno

Pico base tem arbitrariamente o valor de intensidade 100

Espectrometria de Massas
Como funciona?
Existem diversos modelos de espectrmetros que diferem quanto fonte de ionizao ou quanto ao analisador de massas Componentes bsicos de um espectrmetro
Amostra

+ _

Ionizador MALDI Electrospray (ESI)

Analisador de Massa Tempo de vo (TOF) Quadrupolo Ion-Trap

Detector

Mtodos de Ionizao

O ponto de partida para uma anlise por espectrometria de massa a formao de ons gasosos do analito.
O espectro de massa de uma certa espcie molecular altamente dependente do mtodo usado para a formao dos ons. Fontes de ons:

Fontes de ons para a Espectrometria de Massa Molecular


Tipo Bsico
Fase gasosa

Nome
Impacto de eltrons (EI) Ionizao Qumica (CI) Ionizao por campo (FI)

Agente Ionizante
Eltrons energticos ons gasosos reativos Eletrodo com alto potencial Eletrodo com alto potencial Campo eltrico elevado Feixe de laser Feixe atmico energtico Feixe de ons energticos

Dessoro

Dessoro por campo (FD) Ionizao por eletronebulizao (ESI) Dessoro/ionizao com laser auxiliada por matriz (MALDI) Bombardeio com tomos rpidos (FAB) Espectrometria de massa de ons secundrios (SIMS)

Ionizao por termonebulizao

Alta temperatura

Impacto de Electrons
H H-C:H + H
H H-C H H

H H-C H
H H-C + H

+ 2e

CH4

CATION
+ H

Clivagem -Ligao

CATION

RADICAL

H H-C H

+ H+

Um eltron de alta energia pode retirar um eltron da ligao, criando um radical ction (Um on positivo com e- desemparelhado).

100%

43

Pico base 100%


note: 114-71 = 43
58

note: 43 = massa do radical


71 114

50%

ion molecular

m/e

Espectro de Massa

Istopos picos - P+1, P+2, etc

Fontes de ons para a Espectrometria de Massa Molecular


Tipo Bsico
Fase gasosa

Nome e Acrnimo
Impacto de eltrons (EI) Ionizao Qumica (CI) Ionizao por campo (FI)

Agente Ionizante
Eltrons energticos ons gasosos reativos Eletrodo com alto potencial Eletrodo com alto potencial Campo eltrico elevado Feixe de laser Feixe atmico energtico Feixe de ons energticos

Dessoro

Dessoro por campo (FD) Ionizao por eletronebulizao (ESI) Dessoro/ionizao com laser auxiliada por matriz (MALDI) Bombardeio com tomos rpidos (FAB) Espectrometria de massa de ons secundrios (SIMS)

Ionizao por termonebulizao

Alta temperatura

ESI (Electrospray ionization)

IONIZAO
+ 3.500 V Gs nebulizador N2 Anlise massa

Eletrodo

ESI (Electrospray ionization)

http://www.youtube.com/watch?v=K-GhE1uWoV4

MALDI (Matrix laser assisted desorption/ionization) Ionizao/Dessoro de Matriz Assistida por Laser

As amostras so embebidas em uma matrix

A ionizao ocorre atravs da emisso de um laser

Placa

MALDI

a cyano-4-hydroxy cinnamic acid

Matrix (uv absorbing)

peptdeo

Placa
- ve
+ +

MALDI

+ + + + + + + +

- ve

LASER espelho

Analisadores de Massas

QUADRUPOLO
Seleciona determinadas m/z

Analisador de massa

Detector

on ressonante
on no ressonante

Quadrupolo

Amostra
Voltagens

http://www.youtube.com/watch?v=8AQaFdI1Yow

TOF ( Time of Flight) Tempo de vo

Analisador de massa

Distncia fixa

ons com a mesma energia cintica

Vcuo
+

+
+

ons - amostra Mais leve Mais pesado

Detector Tempo de vo menor Tempo de vo maior

Espectro de massa - Etilbenzeno

Pico base tem arbitrariamente o valor de intensidade 100

Espectrometria de Massas em tandem MS/MS


Analisadores de massa so conectados em srie
Ideal para amostras complexas (maior sensibilidade) Fragmentao de peptdeos Clula de Coliso (Gs Argnio)

MS-1

Clula de coliso: o on 237 fragmentado em ons menores

Deteco

ons selecionados passam pelo MS-2

O primeiro (MS1) usado para selecionar, de uma fonte primria de ons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a regio de fragmentao, onde ocorrer a dissociao. No segundo (MS2), haver a anlise dos ons gerados. MS1 uma fonte de ons para MS2.
Cromatografia lquida : ons totais

MS1

MS2

Quadrupolo (MS1)

Clula de coliso

Acelerao - TOF (MS2)

Argon

detector

Quadrupole-Time Of Flight Mass Spectrometry (Q-TOF MS)


Dr Kevin Mills
Institute of Child Health, UCL, London

Espectrometria de Massas em tandem MS/MS

Digesto enzimtica

Fracionamento cromatografia

MS1

Espectrometria de Massas em tandem MS/MS Primeira Espectrometria de Massa (MS-1)

Seleo do on precursor

Segunda Espectrometria de Massa

Seleo do on precursor + fragmentao

MS/MS

Dependendo no tipo de quebra que ocorre (tipo de ligao que quebrada), tem-se a produo de determinados ons: ons C terminal : a, b, c ons N terminal: x, y, z

Fragmentao de Peptdeos

Pares de ons : complementariedade de sequncia a/x b/y c/z

ons resultantes da quebra das ligaes peptdicas !

Fragmentao de Peptdeos
Devido s diferenas na fora das ligaes, diferentes ons ocorrem em diferentes propores

on b

on y

As ligaes peptdicas so as menos energticas, assim espera-se que a formao do par de fragmentos b/y seja mais frequente que os demais pares de fragmentos

Fragmentao de Peptdeos

Peptdeo: S-G-F-L-E-E-D-E-L-K
MW ion 88 b1 S GFLEEDELK ion MW y9 1080

145 292 405 534 663 778 907 1020

b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9

SG FLEEDELK SGF LEEDELK SGFL EEDELK SGFLE EDELK SGFLEE DELK SGFLEED ELK SGFLEEDE LK SGFLEEDEL K

y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1

1022 875 762 633 504 389 260 147

Fragmentao de Peptdeos

88 S 1166 100

145 G 1080

292 F 1022

405 L 875

534 E 762

663 E 633

778 D 504

907 E 389

1020 L 260

1166 K 147

b ions y ions

0 250 500 750 1000

% Intensity

m/z

Fragmentao de Peptdeos
88 145 G 1080 292 F 1022 405 L 875 534 E 762 663 E 633 778 D 504 907 E 389 1020 L 260 1166 K 147 b ions y ions

S 1166

y6 100

% Intensity

y7

y5 b3 y2 y3 b4 y4 b5 500 37 b6 750 b8 y b9 8 y9 1000 m/z

b7

0 250

A A A
Intensity

E E E E P P

P T

ons fragmentados

A
72.0

201.1

298.1

399.2

M/z

Determinao da sequncia

Analisa o espectro buscando diferenas de m/z equivalentes a um resduo de aminocido, que permitem conhecer a seqncia do peptdeos

A
Intensity

72.0 A-0

129.0 AE-A

97.0 AEP -AE

101.0 AEPT -AEP

113.1 AEPTI -AEPT

174.1 AEPTIR -AEPTI

M/z

Workflow para anlise MS/MS

No utiliza Gel Combinao da cromatografia lquida com a espectrometria de massas Ideal para misturas complexas de protenas Identificao de protenas bsicas Identificao de protenas de baixa expresso

A mistura de protenas digerida e separada por cromatografia lquida seguida da identificao dos peptdeos atravs da MS/MS

Envolve uma srie de processos de separao de misturas. A cromatografia acontece pela passagem de uma mistura atravs de duas fases: uma estacionria (fixa) e outra mvel.

Mixtura de Peptdeos

Concentrao de eluente

Separao dos peptdeos

Protemica Shotgun
Cromatografia Lquida ligada em srie com o espectrmetro de massa UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatogragphy) acoplado ao espectrmetro de massa (Q-TOF) - alta presso - microcapilares
Melhor separao

Cromatrografia ligada em srie com espectrmetro

A
A)

B)

Coluna usada na cromatografia tradicional (HPLC) Microcapilar usada em UPLC

Cromatografia Multidimensional (2D-LC) - MudPit


Cromatografia Lquida ligada em srie com o espectrmetro de massa

Combinaes de colunas com fases estacionrias diferentes: troca catinica / hidrofbica ou troca aninica / hidrofbica

Digesto

Troca inica

Fase reversa

SCX

RP

Espectrometria de massas

2D-LC

Cromatografia Multidimensional As colunas so acopladas ortogonalmente Fraes da primeira coluna so seletivamente transferidas para a segunda coluna para uma separao adicional

Anlise dos dados - Bioinformtica

Protena

Peptdeos proteolticos

Espectro de massa

Sequncia da protena

Peptdeos proteolticos tericos

Espectro de massa Terico

As protenas devem ser completamente solubilizadas e desnaturadas


Solubilizao: Quebra das interaes (interaes no covalentes e
pontes dissulfeto) Prevenir a degradao de protenas Reduzir componentes no proticos

Agentes redutores
Agentes Caotrpicos Detergentes

Uria + Tiouria : melhor solubilizao!

Paba et al (2003) Proteomics.

Preparao da Amostra
Remoo de sais
- Interferem diretamente no processo eletrofortico - Causam zonas de alta condutividade, queda de voltagem e diminuio do campo eltrico. - Nessa zonas, as protenas no focalizam e aparecem como faixas

Separao das Protenas

Gel 1D

Gel 2D

Cromatografia lquida

Determinao de Massas para identificao

Gel SDS-PAGE (Poliacrilamida Gel Electrophoresis)


-mercaptoetanol, DTT, SDS e calor para desnaturao

+
Calor, agente redutor e SDS

SDS : detergente fortemente aninico (confere carga negativa s protenas)

O que tem de especial o SDS??


A velocidade de migrao em campo eltrico depende da dimenso, forma e carga das
molculas. Protenas reduzidas e desnaturadas com SDS apresentam a mesma velocidade de migrao quando em eletroforese livre (sem gel, somente tampo).

Assim, quando em um gel de poliacrilamida, estas protenas podem ser separadas por peso molecular

SDS: - romper as estruturas secundrias e tercirias das protenas - confere carga negativa

Gel SDS-PAGE: unidimensional (1D)

Bandas bem definidas

Bandas no definidas

Boa estratgia para comprovar qualidade da extrao de protenas!

Eletroforese bidimensional (2D)

Protenas com a mesma massa

Anlise simultnea de at 5.000 protenas

Protenas com o mesmo pI

Permite comparar todas as protenas expressas por uma clula em condies diferentes Primeira dimenso: separao pelo pI de cada protena (Focalizao isoeltrica) Segunda dimenso: separao pelo peso molecular de cada protena (SDS-PAGE)

Focalizao Isoeltrica: 1a dimenso


As protenas so molculas anfotricas, ou seja, possuem tanto carga positiva como carga negativa A carga lquida de uma protena funo da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga das protenas determinada pelo pH do meio onde esto suspensas O valor do pH onde as cargas se anulam chama-se ponto isoeltrico (pI)

pH cido: inonizam em seus radicais amina carga positiva

pH bsico: ionizam em seus radicais carboxila carga negativa

Gradiente de pH estvel

Focalizao Isoeltrica
Em pH baixo, muitas protenas possuem carga positiva enquanto que em pH alto possuem carga negativa

Quando um campo eltrico aplicado, o ctodo e o nodo movem as protenas at seus pontos isoeltricos onde cada protena possui carga neutra

As protenas pram de migrar, pois atingem seu ponto isoeltrico em um pH especfico.

Ponto isoeltrico no pH 7,5 Ponto isoeltrico no pH 6,8 Ponto isoeltrico no pH 8,5 Ponto isoeltrico no pH 10,1 Ponto isoeltrico no pH 5,6

Aplicar amostra no sarcfago

Focalizao Isoeltrica
Ettan Multiphor 3

Remover proteo da fita

Colocar a fita sobre a amostra

Ettan IPGphor

Poder de Resoluo do gel bidimensional


Faixa de pH mais estreita aumenta o poder de resoluo das protenas

Gel Bidimensional (2D)

Coomassie Blue

2D PAGE: Deteco das protenas

Nitrato de Prata

Fluorescentes
Clulas Normais de Fgado Clulas de Tumor de Fgado

(Invitrogen)

2D PAGE: Deteco das protenas

Mtodos

Sensibilidade

Caractersticas
Compatvel EM Baixo custo Compatvel EM Fcil manuseio Alta sensibilidade Alta sensibilidade Compatvel EM Necessita de instrumento sofisticado para aquisio de imagens
62

Coomassie Blue R 250 Coomassie Blue G 250 Prata

50-100 ng 10 ng 1 ng

Sypro Ruby

1 ng

Anlise das imagens de gis


Presena ou Ausncia de spots Posio de spots (Modificaes ps-traducionais) Volume de spots: quantificao relativa

Proteoma Comparativo ou Diferencial

Condio A

Condio B

Sobreposio permite identificar diferenas nos padres

Anlise das imagens de gis

Anlise das imagens de gis

Retirada e tratamento de spots ou bandas


Exciso de spots do gel : manual ou mecnico

Separao dos Ions


Apenas os ctions so deflected por um campo magntico;

A quantidade de deflection depende da relao m/z. O sinal do detector proporcional ao nmero de hitting no detector; Pela variao do campo magntico, ions de todas as massas so coletados e contados.

Equipamento

Espectro de Massa
Pico base (100%)

GC-MS
Uma mistura de compostos separada por cromatografia, ento identificada por espectrometria de massa.

Alta Resoluo MS
Massas medidas 1 parte em 20,000. Uma molcula com massa de 44 pode ser C3H8, C2H4O, CO2, ou CN2H4. Se a massa mais exata 44.029.......

C3H8 44.06260

C2H4O 44.02620

CO2 43.98983

CN2H4 44.03740

Istopos

81Br

=>

Molculas com Heterotomos

Istopos: presentes em usual abundncia. Hidrocarbonetos contm 1.1% C-13, ento sempre ter um pequeno pico M+1. Se Br est presente, M+2 igual a M+. If Cl est presente, M+2 um tero de M+. If I , est presente pico em 127;. If S est presente, M+2 ser 4% de M+.

Espectro de Massa com S

Espectro de Massa com Cl

=>

Espectro de Massa com Br

=>

Espectro de Massa com Alcanos

=>

Espectro de Massa com Alcenos


Ressonncia estabilizando ctions favorveis

=>

Problema 1

Problema 1

Problema 2

Problema 2

Problema 3

Problema 3

Problema 4

Bibliografia SILVERSTEIN, R. M., WEBSTER, F. X., KIEMLE, D.J., Spectrometric Identifications of Organic Compounds, seventh edition, John Wiley and Sons, Inc., 1997.

MURADIAN. J., Espectroscopia no infravermelho, IQ-USP, So Paulo, 1978.


WILLARD, M., MERRITT, Jr & DEAN, J., Anlise Instrumental, Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, 1974. RUSSELL, D.H., Ed. Experimental Mass Spectrometry. New York: Plenum Press. 1994