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TEMA 2
Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de aplicacin industrial. Presentan numerosas ventajas
Los microorganismos son muy verstiles y tericamente se puede encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto. Los microorganismos pueden ser modificados genticamente para producir mayor cantidad de enzima. La recuperacin de las enzimas microbianas suele ser fcil, puesto que, generalmente, son extracelulares. La produccin de enzimas microbianas requiere materias primas fciles de conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos. Los microorganismos son fciles de cultivar, tienen velocidades de crecimiento y de produccin de enzimas muy alta (baratas, abundantes) La tecnologa a gran escala para su produccin se encuentra hoy bien establecida. Fcil escalado Las enzimas microbianas son homlogas de plantas y animales. ms estables que sus
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ENZIMAS INTRACELULARES: permanecen en el interior de la clula. Actan sobre sustratos de bajo peso molecular. Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acilasa, galactosidasa pullulanasa y lactasa. Es necesaria la integridad de la clula para que se sintetice el enzima y preservar su estabilidad. Para obtener el producto es necesario romper las clulas y separar el producto de los restos celulares. Operacin difcil y costosa Las enzimas aparecen contaminadas con otras protenas intracelulares. La separacin de las clulas del medio de cultivo permite obtener preparados muy concentrados que facilitan la purificacin
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ENZIMAS EXTRACELULARES: actan sobre sustratos de alto peso molecular. Se sintetizan en grandes cantidades. Muy reguladas. Hidrolasas Dado que la molcula es segregada fuera de la clula, no se requieren tcnicas de ruptura celular que a veces son difciles de aplicar a gran escala. El nmero de protenas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fcil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura ms compacta y menos susceptibles a la desnaturalizacin que las correspondientes intracelulares. intracelulares
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TEMA 2
OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Maximizar la velocidad de sntesis de enzima y su concentracin para reducir costos. Experimentacin previa en el laboratorio: Ciclo celular. Requerimientos nutricionales. Constitutiva o inducible. Intracelular o extracelular. Mecanismos de control de su sntesis.
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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Seleccin de una cepa, a partir del medio natural o de colecciones de cultivo. Factores a considerar: Criterios de seguridad: daos sobre el producto (propio organismo o por un metabolito) contaminacin con toxinas Debe crecer en medios simples y baratos Estable en sus propiedades genticas Producir alta cantidad de producto en poco tiempo Fcil de separar
ORGANISMOS TERMFILOS
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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Mejora de estirpes Incrementar la productividad de la enzima Reducir o eliminar enzimas contaminantes Conseguir inductores Permitir su inadecuadas su sntesis sin necesidad de sntesis en condiciones
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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Formulacin y preparacin del medio de cultivo: baratos y fciles de reproducir. Consideraciones: Requerimientos nutricionales (C,N,P,S,O,Mg,Ca,etc.) Propiedades de la enzima: Induccin Represin por catabolitos Inhibicin por producto Mecanismos de liberacin Esterilizacin Extraccin de la biomasa y recuperacin de enzima
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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Diseo del equipo y del proceso de fermentacin FERMENTACIN EN SUSTRATO SLIDO: sustrato insoluble sin fase lquida libre
El proceso est limitado a hongos Difcil medida de los parmetros del proceso Difcil control del pH, T, transferencia de oxgeno La mayora de los sustratos requieren un pretratamiento Medios de cultivo muy simples No suele haber contaminacin bacteriana- esterilizacin Enzima se recoge muy concentrado No es necesario mantener inculos
FERMENTACIN SUMERGIDA
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PURIFICACIN
Consideraciones Generales
Necesidad
de purificacin
Prdida del enzima: prdida fsica inactivacin pH y temperatura formacin de espuma Proteasas agentes quelantes.
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Agentes reductores Concentracin rpida Restauracin de ese factor Separacin del inhibidor Agentes quelantes Mnima agitacin
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ROTURA CELULAR
Detergente
Tamizacin lquida
Tratamiento enzimtico
Choque osmtico
Tamizacin slida
SEPARACIN SLIDO-LQUIDO
Centrifugacin CONCENTRACIN
Filtracin
Precipitacin
Adsorcin
Secado
Liofilizacin
Ultrafiltracin
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EXTRACCIN
CONSIDERACIONES PARTICULARES: SEGN LA NATURALEZA INTRACELULAR EXTRACELULAR Necesidad o no de rotura celular SEGN LA FUENTE DE ENZIMA: Microorganismos Animales Vegetales O
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MTODOS DE ROTURA
1. Mtodos qumicos de lisis celular:
1.1 lcali 1.2 lisozima y EDTA 1.3 detergentes: inicos no inicos
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CONCENTRACIN Y ENRIQUECIMIENTO
1er paso: Eliminacin de cidos nucleicos: pH alto, fuerza inica baja, nucleasas 2 paso: Eliminacin de restos celulares:
Centrifugacin Filtracin
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Adsorcin
Polisacridos aninicos Polisacridos catinicos Cromatografa de afinidad Otros
Ultrafiltracin Secado
Evaporacin rotatoria Secado en spray Liofilizacin
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Porosidad
Baja Baja Alta Alta Alta Media Media Baja/media Media/alta Baja/media Media/alta
Adsorcin noespecfica
Baja Baja Baja Baja Media Baja Media Media Alta Alta Baja
Rigidez
Baja Baja Baja Media Media Media Media Media Baja Alta Alta
Estabilidad
Buena Buena Deficiente Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena
Facilidad de modificacin
buena buena buena buena buena buena buena buena buena deficiente buena
Coste relativo
Bajo/medio Medio Medio Medio Medio Medio/alto Medio Medio Bajo Alto Alto
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TCNICAS DE PURIFICACIN
Cromatografa Intercambio inico Cromatoenfoque Afinidad Interaccin hidrofbica Filtracin en gel HPLC Sistemas acuosos en dos fases
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Carga
Intercambio inico
Cromatoenfoque
Es mejor usarla en una purificacin posterior, ya que las matrices son caras. Puede ser utilizada en cualquier fase, pero es mejor aplicarla cuando la fuerza inica es alta tras la precipitacin con sales o despus de un inter-cambio inico Puede emplearse en cualquier etapa, aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases
Polaridad
Interaccin hidrofbica
Afinidad biolgica
Afinidad
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TCNICAS DE PURIFICACIN
Solucin acuosa de dos polmeros
PEG y dextrano
- Aplicaciones: Separacin de restos celulares Enriquecimiento para posteriores pasos de purificacin Concentracin y purificacin de protenas en baja concentracin - Operacin: - Mezcla y equilibrado - separacin
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TCNICAS DE PURIFICACIN
Diseo de enzimas: La fusin de un gen de inters a secuencias promotoras eficientes hace que una protena se sobreexprese. Dirigir la protena sintetizada de novo al periplasma de la clula. Adicin de colas de afinidad.