ELECTROFORESIS

INTRODUCCION
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.

Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este termino se limito originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscopicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular.

FUNDAMENTO
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo).

 El movimiento de las molculas esta gobernado tambin por dos fuerzas

adicionales; inicialmente la friccin con el solvente dificultar este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin.

La energa cintica de las molculas aumenta con la temperatura, por ello a

mayor temperatura mayor difusin. La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no migren de una manera homognea, de tal manera que, si las molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.

TIPOS DE ELECTROFORESIS
Electroforesis de Frente Mvil
Las molculas estn presentes en toda la disolucin y su posicin se determina en funcin del tiempo por la ptica de Schlieren- tcnica analtica utilizada para determinar el movimiento y punto isoelctrico de protenas. Debido a que la utilidad de la determinacin cuantitativa de la movilidad es poco utilizada, este tipo de electroforesis tambin lo es.

Electroforesis continua

La muestra se aplica tambin en una zona pero se aade continuamente a lo largo del proceso.

 Mtodos electroforticos zonales

Son los ms comunes debido a su alta aplicabilidad en diferentes campo, con el fin de separar mezclas complejas. Esta tcnica se utiliza para analizar muestras, para determinar la pureza de las muestras, para detectar cambios de movilidad o conformacin, y para la purificacin de sustancias. La determinacin cuantitativa de la movilidad nunca se realiza, debido a la imposibilidad virtual de los efectos que produce el soporte en el proceso electrofortico. En cambio posee un gran poder resolutivo ya que al aplicar una pequea cantidad de protena en una zona estrecha la longitud del trayecto es mayor que la zona de aplicacin

MTODOS ELECTROFORETICOS ZONALES

Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

 Electroforesis en geles de gradientes.

El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de

concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.

a) electroforesis con geles- SDS

b) Electroforesis discontinua con geles de poliacrilamida: Tcnica que se utiliza para conseguir mximas resoluciones. Consiste en concentrar una fina capa de muestra.

 Electroforesis en geles de agarosa.

La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agaragar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.

 Electroforesis capilar .
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos permiten obtener una serie de ventajas al respecto, Esta separacin de pptidos realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin . La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.

 Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas amfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isolctrico, tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas amfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico con el pH.

 Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa en separar las protenas en una mezcla segn sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensin. El procedimiento ms usado se basa en la separacin en una primera dimensin mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensin segn peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

 Fuentes de error en la electroforesis.

La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras.