BT51A

MTODOS DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

Lunes 30 de Julio 2007 Prof. Oriana Salazar

Es Importante Diferenciar dos Conceptos

Extraccin: sacar los componentes desde un compartimento celular. Involucra:
Lisis de las clulas que contienen a los AN Inactivacin de nucleasas Clarificacin: separacin de los AN de los restos celulares (debris).

Purificacin: Separacin de AN:

De protenas solubles De otros AN no deseados De Lpidos, carbohidratos De sales y otros compuestos orgnicos

EL PROBLEMA
Para muchas aplicaciones que involucran manipulacin de AN es necesario disponer de stos en estado puro. Por qu purificar?

Nucleasas que se liberan al lisar las clulas degradan los cidos nuclicos. Interferentes que inhiben a las enzimas que se usan en ingeniera gentica.

El

desafo es separar los cidos nuclicos deseados desde una mezcla compleja, manteniendo la integridad de los AN
Contaminantes:

Protenas, lpidos y carbohidratos, sales del medio, iones, etc.

Etapas bsicas de un procedimiento general para Extraccin y Purificacin de AN

Disgregacin o fragmentacin del tejido

Estas etapas deben ir acompaadas de medidas o agentes que inactiven nucleasas celulares

Lisis celular
Durante todo el procedimiento se

Clarificacin

debe usar soluciones y material estril, ademas

Purificacin

de guantes

Cualitativo: electroforesis

Anlisis

Cuantitativo: espectrofotometra UV

1. Mtodos de fragmentacin y lisis celular para la extraccin de AN

El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (clulas o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las molculas de inters (ADN o ARN).
Mtodos fsicos Homogenizacin mecnica, Homogenizacin en solucin Molienda manual en mortero Bolitas de vidrio Sonicacin Mtodos enzimticos
Lysozima: rompe enlaces -1.4- entre N-acetil murmico y Nacetil glucosamina de peptidoglicn de la pared celular de bacterias Lyticasa: rompe enlaces -1.3 de glucano de levaduras Proteasas: rompe enlaces peptdicos de prot. de pared y membrana plasmtica e interacciones clula-clula.

Mtodos qumicos Detergentes

Ruptura de clulas por medios fsicos

Table 1. Techniques used for the physical disruption of cells. Lysis Method Mechanical Description Waring Blender Polytron Dounce Homogenizer Potter-Elvehjem Homogenizer French Press Sonicator Freezer or dry ice/ethanol Mortar and pestle Apparatus Rotating blades grind and disperse cells and tissues

Liquid Homogenization

Cell or tissue suspensions are sheared by forcing them through a narrow space

Sonication Freeze/Thaw Manual grinding

High frequency sound waves shear cells Repeated cycles of freezing and thawing disrupt cells through ice crystal formation Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen

Sonicador Homogenizador Dounce Homogenizador mecnico - polytron

Mtodos para lisar clulas

Otros componentes de una solucin de lisis

Debe Incluir

Etilen diamino tetracetico (EDTA). Quelante de iones Mg2+, baja la concentacin

efectiva de este in.

Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza

la degradacion de AN durante la extracin/purificacin.

Amortiguador de pH (7-8).

SDS

Triton

2. Clarificacin. Eliminacin de restos celulares (debris)

Centifugacin

Filtracin
Mtodo mixto: enzimas + centrifugacin

3. Purificacin
Desproteinizacin con fenol, que al denaturar
protenas causa su precipitacin.

Precipitacin de protenas con sales (salting out)

Cromatografa
De intercambio inico De adsorcin a slica De filtracin

Extraccin de DNA desde un gel de agarosa

Extraccin Fenlica de protenas

fenol

Cromatografa de intercambio aninico

Adsorcin de DNA a slica (una teora sobre el mecanismo )

DNA eluye de la slica en agua

DNA se une a la slica en NaI

Separacin de fragmentos de DNA

desde un gel de agarosa

Electroforesis de la mezcla de fragmentos en un gel de agarosa de bajo punto de fusin Solubilizacin por Temperatura (~ 60 C) Purificacin por cromatografa en columna para eliminar agarosa y otros contaminantes

Anlisis espectrofotomtrico de AN y criterios de pureza

Longitud de onda Razn Abs230/Abs260 debe ser menor de 0.5 (> sugiere contaminacin con fenol/CHCl o carbohidratos). Razn Abs260/Abs280 debe ser ~1.8 (< sugiere contaminacin con protenas, Abs320 se debe a difraccin de la luz por material particulado en la muestra. Debera ser baja.

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los AN purificados

Cantidad de material de partida
Nmero de copias de las molculas de AN Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) Contaminantes e interferentes en el material biolgico Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza

Mtodos Especficos

Extraccin de DNA plasmidial desde bacterias: Mtodo de Lisis alcalina

Centrifugacin del cultivo Resuspensin en solucin amortiguadora de pH + EDTA. Lisis y desnaturacin alcalina
1. SDS, un detergente que disuelve lpidos de membrana. Desnaturante de protenas. 2. NaOH (pH >12): 1. Debilita la pared celular y libera el contenido de la clula. Ayuda en la desnaturacin de protenas. 2. Desnatura el DNA. Las dos hebras del DNA (cromosomal y plasmidial) se separan.

Extraccin de DNA plasmidial desde bacterias (cont)

Neutralizacin en acetato de amonio pH ~ 5.
1. El DNA circular plasmidial se renatura. DNA cromosomal de alto peso molecular lineal permanece desnaturado (ssDNA). 2. El ssDNA precipita ya que molculas grandes de ssDNA son insolubles en alta concentracin de sales (5M). Coprecipitacin de membranas y debris celular. 3. La adicin de acetato de potasio al SDS forma KDS,que es un complejo insoluble (ayuda a la remocin de SDS de la solucin).

Preparacin de DNA por el mtodo de lisis alcalina

Electroforesis de DNA plasmidial

Velocidad de migracin en geles de agarosa

Extraccin y purificacin del DNA cromosomal de bacterias

Sedimentacin de las clulas de un cultivo . Resuspensin de las bacterias en buffer e incubacin en detergente (SDS), proteinasa K

Extraccin con fenol

Precipitacin de los cidos nucleicos con EtOH/NaCl. Sedimentacin del DNA por centrifugacin. Tratamiento con Ribonucleasa A. Precipitacin del DNA con isopropanol.

Resuspensin del DNA en buffer con EDTA.

Extraccin de DNA genmico desde Timo

Tejido de timo

Adicin de amortiguador de pH, con EDTA

Adicin de detergente

Molienda-lisis

Tomar alcuota

Adicin de una sal (NaCl) (salting out)

AN en solucion acuosa

Proteina insoluble

Centrifugacin

Adicin de etanol

DNA es insoluble en solucin alcohlica

Centrifugacin

Sobrenadante

Sedimento

Disolucin en una solucin acuosa

Extraccin y Purificacin de RNA

RNA total o Sub-celular (citoslico y nuclear) Lo primero es minimizar la actividad de RNAasa liberadas desde las clulas lisadas durante el proceso de extraccin La cantidad de RNasa depende del tipo de clulas Las RNAasas son muy resistentes (resisten T de ebullicin, autoclavado, denaturacin con denaturantes fuertes). Por lo tanto, en lo posible deben ser eliminadas, no slo inhibidas.
tratamiento del material de vidrio y de la soluciones, uso de guantes, y mantencin de un ambiente libre de Rnasas. Uso de inhibidores de RNAasa

Denaturantes fuertes (HCl Guanidina o tiocianato de guanidinina con agentes reductores).

E/P RNA total

Lisis en presencia de agentes desnaturantes fuertes de protenas (Tiocianato de guanidina, fenol cido) para INACTIVACION DE RNasas Extraccin con fenol cido (pH 4.5)
Precipitacin con etanol Se obtiene mezcla de mRNA, rRNA y tRNA Purificacin de mRNA mediante cromatografa de afinidad a poli-dT

E/P de RNA