TRANSGENESIS EN ANIMALES

DUVERNEY GAVIRIA ARIAS

El inicio

Hipoxantina fosforibosil transferasa

Aplicaciones
Actualmente est bien establecido que la transgnesis es una de las principales herramientas de los bilogos para estudiar:
Expresin y funcin de genes Esencial para las aplicaciones en los campos de la medicina y agronoma. Enfermedades humanas se facilita mucho la generacin de animales transgnicos que imitan trastornos de salud o permitir la evaluacin de nuevas productos farmacuticos. Cerdos transgnicos se espera que los ser la fuente de rganos y clulas para trasplante a los seres humanos. Las protenas recombinantes de los productos farmacuticos inters se estn preparando en la leche de animales transgnicos. Unas pocas lneas o animales de granja que tienen propiedades mejoradas de cra han sido generado y estn en estudio para humanos consumo.

Mtodos
Microinyeccin de ADN Transposones El uso de vectores retrovirales Transferencia de ADN en gametos Transferencia de genes con el uso de clulas embrionarias Transferencia de genes por transferencia nuclear

Microinyeccin de ADN
La microinyeccin se refiere al proceso de utilizacin de una micropipeta de vidrio para insertar sustancias a un nivel macroscpico o microscpico lmitado a una sola clula viva.
Aguja de aproximadamente 0,5 a 5 micrmetros de dimetro penetra la membrana celular y / o la envoltura nuclear. Los contenidos deseados se inyecta entonces en el deseado subcompartimento celular y se retira la aguja.

El proceso se utiliza con frecuencia como un vector en la ingeniera gentica y los transgnicos para insertar material gentico en una clula individual. Primera tcnica que condujo para el xito regular y relativamente fcil en los mamferos.
ratn, rata, conejo, cerdo, oveja, cabra y vaca. Disminuye la eficiencia en este orden

En insectos (Drosophila melanogaster) y gusanos (Caenorhabditis elegans)

ADN se inyecta en el sincitio de la gnada.

Transposones
Segn contenido
Transposn simple, secuencia de insercin o elemento de insercin (IS): contienen una secuencia central con informacin para la transposasa, una enzima necesaria para la transposicin, y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso.
Esta secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente idntica, aunque muy parecida. Integracin en un determinado punto del ADN aparece una repeticin directa de la secuencia diana (5-12 pb).

Transposn compuesto (Tn): contienen un elemento de insercin (IS) en cada extremo en orden directo o inverso y una regin central con la transposasa que adems suele contener informacin de otro tipo.
factores de transferencia de resistencia (RTF)
cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina,

Transposones
Segn estrategia de transposicin
Clase I o retrotransposones: se mueven en el genoma siendo transcritos a ARN y despus en ADN por retrotranscriptasa. A su vez, se clasifican en los de origen retroviral (retrotransposones con LTR) y de origen no retroviral (retrotransposones sin LTR). Clase II o DNA transposones: se mueven directamente de una posicin a otra en el genoma usando una transcriptasa para copiar y pegarse en otro locus del mismo. Clase III o MITE, por sus siglas en ingls "Miniature Inverted-repeats Transposable Elements".2

Transposones
Segn mecanismo de transposicin Transposicin conservativa: el transposn sale de la sede donadora que queda vaca y se incorpora en una nueva sede (sede receptora). No aumenta el nmero de copias del transposn en el interior de la clula.
Se expresa la transposasa, y realiza dos cortes de doble cadena a la misma altura en el genoma donante, dejando aislado el transposn. A continuacin localiza una secuencia diana (pongamos, ATGCA) en el genoma aceptor, y realiza un corte cohesivo.
ADN polimerasa

Queda, sin embargo, un hueco en el genoma donante, que puede ser letal si no se repara. Realmente, en este caso se habla ms de recombinacin que de transposicin.

Transposones
Transposicin no conservativa: en este caso la transposasa realiza un corte cohesivo no solo en la secuencia diana, sino tambin en el genoma donante, dejando un corte a cada lado del transposn.
Estructura entrecruzada. Esta estructura es resuelta por un segundo enzima, la resolvasa, que segn cmo lo resuelva dar lugar a una de las siguientes transposiciones:
Transposicin no replicativa: el genoma donante se libera, dejando el integrn en el genoma receptor. Al igual que en la transposicin conservativa, queda un hueco en el genoma donante, que puede ser letal si no se repara. Transposicin replicativa: se produce una replicacin desde los extremos 3 del genoma aceptor, lo que acaba por duplicar el transposn, y produciendo un genoma mixto llamado cointegrado. A continuacin la resolvasa rompe el cointegrado mediante una recombinacin recproca, que une los extremos del ADN aceptor original (ahora con una de las copias del integrn) y libera el genoma donante de nuevo con su transposn.

Elementos transponibles como vectores

Elementos transponibles tipo II
Elemento - P Minos Hermes Mos1 piggyBac

Elemento P
Elemento altamente movil
Elevadas tasas de mutacin Rearreglos cromosmicos Esterilidad Disgenesis hibrida
Esterilidad dependiente de temperatura Altas tasas de mutacin Rearreglo cromosmicos

Caractersticas
Tamao de 2.9kb Repeticiones repetidas terminales de 31pb

http://engels.genetics.wisc.edu/Pelements/fig 1.html

Minos
Drosophila hydei Perteneciente a la flia de transposones Tc1/Mariner
Tamao de 1.8kb Terminaciones invertidas de 254pb Transposas con dos exones con intron de 60pb Transferencia gentica horizontal entre las spp de Drosophila

Hermes
Musca domestica Amplia distribucin en los eucariotas Familia de transposones hAT Repeticiones invertidas de 31pb Producto gnico 400 aa

Mariner - Mos 1
Drosophila mauritiana
Tamao de 1286pb Repeticiones terminales invertidas de 28pb Transposas de 343aa Activo en diferentes taxa Microorganismos
Leishmania major

Vertebrados
Danio rerio Gallus gallus

piggyBac
Trichoplusia ni Identificado inicialmente como IFP2
Transposon de clase II
Tamao de 2,5Kb Terminales invertidas de 13pb Sitio de reconocimiento TTAA Usado para transformar varios ordenes en insectos Producto gnico 64Kda

Sleeping Beauty

Transposones
Debido a las bajas frecuencias de integracin del ADN foraneo en el genoma del organismo
medaka, Drosophila, pollo, gusanos de seda

Uso de estrategias alternativas

Generacin de roturas en el ADN husped mediante la inyeccin bajas cantidades de enzimas de restriccin al ADN. Mecanismo de reparacin del ADN restaura integra el ADN extrao.
Difcil de manejar Estandarizacin cantidad de enzima

Estrategias de transcomplementacion

Representantes
I: dsDNA viruses (e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses) II: ssDNA viruses (+)sense DNA (e.g. Parvoviruses) III: dsRNA viruses (e.g. Reoviruses) IV: (+)ssRNA viruses (+)sense RNA (e.g. Picornaviruses, Togaviruses) V: ()ssRNA viruses ()sense RNA (e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses) VI: ssRNA-RT viruses (+)sense RNA with DNA intermediate in life-cycle (e.g. Retroviruses) VII: dsDNA-RT viruses (e.g. Hepadnaviruses)

Principales vectores
Lentivirus
Group VI (ssRNA-RT)

Adenovirus
Grupo I (dsDNA)

Virus adenoasociados
Group II (ssDNA)

Vectores retrovirales
Los vectores retrovirales han sido utilizado con xito para la terapia gnica. Tales vectores estn generado por las clulas que constitutivamente sintetizan las protenas vricas gag, pol y env y expresar el ADN recombinante que contiene los dos LTRs, secuencia de encapsidacin y el gen de inters.
Clulas germinales primordiales de pollo Ovocitos de vaca Ovocitos de Mono Clulas precursoras de los espermatozoides en ratn Embriones de mamfero

Retrovirus
Un retrovirus es un virus de ARN que se replica en una clula husped. Utiliza su propia enzima transcriptasa inversa para producir el ADN de su genoma de ARN. Este nuevo ADN es incorporado en el genoma del husped por la enzima integrasa
La clula sigue a ciegas, haciendo que las protenas requeridas para montar nuevas copias del virus.

Los retrovirus son virus envueltos que pertenecen a la familia Retroviridae viral.

Estructura gentica
El genoma del virus toma la forma de un ARNm de polaridad positiva, incluida la cap 5' y la poly-A 3' dentro del virin. En el caso del VIH, el genoma consta de dos molculas de ARN de cadena simple y polaridad positiva.
Las molculas de ARN estn fsicamente unidas mediante puentes de hidrgeno en sus extremos 5 Difcil la encapsidacin de ms de 2 molculas en un provirus.

La organizacin genmica es siempre la misma, 5'-Gag-Pol-Env-3', genes accesorios que se solapan con los genes principales. Partcula viral se compone de:
Envoltura formada por una glicoprotena de superficie (SU) y una protena de transmembrana (TM). Cpside viral o core que incluye las protenas de la matriz (MA), cpside (CA) y nucleocpside (NC). Enzimas como la transcriptasa inversa (RT), proteasa (PR), integrasa (IN), que son muy importantes para la replicacin del virus. Otras protenas no esenciales para el virus.

Lentivirus
Lentivirus (lente-, en latn para "lento")
Largo perodo de incubacin. Pleomorfos

Los lentivirus puede entregar una cantidad significativa de ARN viral en el ADN de la clula husped
Capacidad nica entre los retrovirus de ser capaces de infectar clulas que no se dividen Mtodos ms eficaces de un vector de administracin gnica.
VIH VIS VIF

Caractersticas del genoma

Virus infecciosos y 3 principales genes que codifican para las protenas virales:
5'-gag-pol-env-3 '

Existen genes adicionales/accesorios

VIH-1: vif, vpr, vpu, tat, rev, nef
Involucrados en la regulacin de la sntesis y procesamiento de ARN viral y otras funciones replicativas .

La repeticin terminal larga (LTR) es de aproximadamente 600nt largo, de los cuales la regin U3 es 450nt, la secuencia R de 100nt y la regin U5 70 nt de largo. Aunque la transmisin es generalmente a travs de partculas infecciosas, los lentivirus son capaces de infectar las clulas vecinas en contacto directo con las clulas husped, sin tener que formar partculas extracelulares.

cido nucleico
Los viriones contienen 2% de cido nucleico
Genoma consiste en un dmero Los viriones contienen una molcula de lineales de sentido positivo de ARN de cadena simple. La longitud total del genoma es de un monmero de 9200 nt Secuencia del genoma tiene secuencias terminales repetidas; repeticiones terminales largas (LTR)
600 nc

El extremo 5 'del genoma tiene una capucha

Tipo 1 m7G5ppp5'GmpNp

Extremo 3 'de cada monmero tiene un poli (A); extremo 3' tiene una estructura similar a tRNA (lisina) cido nucleico encapsidado son nicamente genmico 2 copias por partcula formando dimero

Otras biomoleculas..
Hay 11 protenas (60%)
Cinco las protenas estructurales del virin
Mayor 120000 Da (Dalton). Gp120 sobre glicosilada superficie de la protena SU, codificada por el gen env viral 41000 Da. Gp41 transmembrana glicosilada protena de la envoltura TM, tambin codificada por el gen env viral 24000 Da. P24 no glucosilada CA protena de la cpside. 17000 Da. P17 no glucosilada MA protena de la matriz. 7000-11000 Da. No glicosilada NC protena de la cpside.

Las protenas MA, CA y NC (4,3 y 5) son codificadas por el gen gag. Las protenas de la envoltura SU y TM son glicosiladas en lentivirus (VIH, SIV). Por lo general, cuatro (4) protenas no estructurales encontrados, o tres (3) protenas no estructurales encontradas (en los lentivirus de primates).
66000 Da. La transcriptasa inversa codificada por el gen pol. 32000 Da. La integrasa IN tambin codificada por el gen pol Protena tamao de la 3 14000 Da. PR proteasa codificada por el gen pro. dUPTase DU, el papel de los que an se desconoce.

Lpidos: Los viriones contienen un 35% de lpidos. Hidratos de carbono: Otros compuestos detectados en los carbohidratos partculas

Lentiviris
Por razones de seguridad, ningn lentivirus porta los genes necesarios para su replicacin. Para producir un lentivirus, varios plsmidos se transfectaron en una lnea de envasado as llamada clula, comnmente HEK 293. Uno o ms plsmidos, generalmente se conoce como plsmidos de encapsidacin, codifican las protenas del virin.
cpside y la transcriptasa inversa.

Otro plsmido contiene el material gentico para ser entregado por el vector. Se transcribe para producir el genoma de ARN monocatenario viral y se caracteriza por la presencia de la (psi) secuencia.
Secuencia de empaquetamiento del genoma en el virin.

Adenovirus
Los adenovirus son los mayores virus no envueltos. Debido a su gran tamao, que son capaces de ser transportados a travs del endosoma. El virin tambin tiene un nica fibra asociada con cada base de pentn de la cpside que ayuda en la unin a la clula husped a travs del receptor coxsackie-adenovirus en la superficie de la clula husped. En 2010, los cientficos anunciaron que haban resuelto la estructura del adenovirus humano a nivel atmico El virus est compuesto de alrededor de 1 milln residuos de aminocidos y pesa alrededor de 150 MDa.

Adenovirus
El genoma del adenovirus es lineal, no segmentado de doble cadena (ds) de ADN entre 26 y 45 Kbp. Esto permite que el virus transporte tericamente 22 a 40 genes.
Aunque esta es significativamente mayor que otros virus an es un virus muy sencilla y es muy dependiente de la clula husped para la supervivencia y la reproduccin. Genoma viral es que tiene unas protenas asociadas de 55 kDa con cada uno de los extremos 5 'de la ADN de doble cadena lineal.
Se utilizan como cebadores en la replicacin viral y asegurarse de que los extremos del genoma lineal del virus se replican adecuadamente.

Virus adenoasociados
Virus adeno-asociado (AAV) son virus pequeos que infecta a los seres humanos y algunas otras especies de primates.
Provoca una respuesta inmunitaria muy leve.

Vectores de terapia gnica que utilizan AAV puede infectar slo clulas que se dividen y persisten en un estado extracromosmico sin integrarse en el genoma de la clula husped.
Estas caractersticas hacen que AAV es un candidato muy atractivo para la creacin de vectores vricos para terapia gnica Modelos de enfermedades humanas isognicas.

Los recientes ensayos clnicos en humanos utilizando AAV para la terapia gnica en la retina han mostrado ser prometedores.

Ormosil
Frase abreviada de slice orgnicamente modificada o silicato modificado orgnicamente. Estos son materiales de ingeniera que muestran una gran promesa en una amplia gama de aplicaciones tales como:
Alternativa a los vectores virales para la entrega de genes, con mayores eficiencias de transfeccin transitoria Medio de suspensin y soportes para clulas solares de siguiente generacin (puntos cunticos) matriz de material para el recubrimiento de proteccin UV

Esta tecnologa funciona como vector no viral para entregar con xito cargas de ADN especficamente en los animales vivos.
El ADN fue expresados en el animal.

Transferencia de ADN en gametos

Espermatozoides incubados con ADN y utilizados para la fertilizacin generaron ratones transgnicos.
Ratones Pollo Pescado Vacas Conejos Cerdos Ovejas

Resultados incompatibles bajo rendimiento e impredecible. El ADN es la mayora de las veces profundamente reorganizado y no funcional.
Inactivacin de ADNasas del esperma
Lavados Inhibidores

Transferencia de ADN en gametos

ADN lineal que contiene un gen funcional ligado en forma no covalente a un anticuerpo monoclonal
antgeno especfico espermatozoides

Los espermatozoides fueron incubados con el complejo anticuerpo-ADN y utilizado ms para fecundar los ovocitos mediante fertilizacin in vitro
Raton Pollo Cerdos 30% de los animales nacidos eran transgnicos.

Los transgenes se expresa y se transmite a progenie sin reordenamiento. Anticuerpo reconoce el mismo antgeno en varios mamferos incluyendo humanos y en vertebrados inferiores.

Transferencia de ADN en gametos

Microinyeccin de ADN en los ovocitos Recientes experimentos mostraron que retroviral vectores introducidos entre la zona pelcida y la membrana plasmtica de los oocitos puede ser implementado para generar vacas transgnicas Este xito se cumpli con las partculas virales que contienen el sobre VSV-G, que se sabe que reconocen fosfolpidos de la membrana de todos los tipos celulares.
La infeccin se realiz en un periodo en el membrana nuclear del ovocito fue inexistente.
Permiti aumentar la probabilidad de que el recombinante retroviral alcanzara el genoma del husped

Transformacin de primates

Transferencia de genes con el uso de clulas embrionarias

Esto se puede conseguir en las clulas somticas de mamferos aunque con una eficacia relativamente pobre.
La recombinacin homloga es ms frecuente en las clulas embrionarias pluripotentes.

Este enfoque es muy atractivo

Inactivacin de genes especficos Dirigidos a mutacin puntual en un genoma de animal Reemplazo de un gen dado por uno no-relacionado.

Transferencia de genes por transferencia nuclear

Tcnica desarrollada hace mas de 40 aos El ncleo de una clula somtica se retira El ncleo de una clula germinal se retira
Clula desprogramada

El huevo, que ahora contiene el ncleo de la clula somtica, se estimula con un choque y empiezan a dividirse.

Reprogramacin nuclear
La reprogramacin se refiere a la supresin y la remodelacin de las marcas epigenticas
Metilacin del ADN

Despus de la fertilizacin algunas clulas del embrin recin formado migrar a la cresta germinal y eventualmente se convertir en las clulas germinales (espermatozoides y oocitos).
Debido al fenmeno de la impronta genmica, genomas materno y paterno son diferencialmente marcados y debe ser adecuadamente reprogramado cada vez que pasan a travs de la lnea germinal.

Por lo tanto, durante el proceso de la gametognesis las clulas germinales primordiales deben tener sus originales patrones de metilacin del ADN biparentales borrado y restablecido basado en el sexo del padre transmisor. Despus de la fertilizacin de los genomas paterno y materno, una vez ms desmetilado y remetilado (a excepcin de las regiones diferencialmente metilado asociados con los genes impresos). Esta reprogramacin es probablemente necesaria para totipotencia del embrin recin formado y supresin de los adquiridos cambios epigenticos.
En la manipulacin in vitro de embriones de preimplantacin se ha demostrado que alteran los patrones de metilacin en los loci impresos y desempea un papel crucial en los animales clonados.

 Crio preservacin de celular

U$895 - U$1395

Texas A&M
$250,000 Clonar un gato

Integracin dirigida a un gen extrao