Marcadores Genticos y Pruebas de Filiacin

EL GENOMA HUMANO
Cules fueron los hallazgos en el proyecto genoma humano ? 99.8% de identidad entre individuos ~ 1% de diferencia con el genoma del chimpanc 3% del DNA es codificante ~ 30-35.000 genes ~ 3 billones de pares de bases (3 X 109 bases)

ADN PRESENTE EN EL GENOMA HUMANO

DNA EXPRESIVO 30% DNA NO CODIFICANTE 70%

ADN REPETITIVO 20 30%

Secuencias repetidas en tndem 10%

Secuencias dispersas 15 20%

Satlites: Clsicos Alfoides

Minisatlites Microsatlites

SINEs: Alu

LINEs: L1

CUL ES EL APORTE DEL PROYECTO GENOMA HUMANO (1990-2003) ?

Conocimiento

total de la secuencia de las molculas de DNA presentes en el genoma humano Comprensin de la funcin de la gran mayora de nuestros genes, cuya utilidad desconocemos Posibilidad de pronosticar enfermedades Diagnstico temprano de las patologas y eventualmente su correccin y posibilidad de curar enfermedades

 El

ADN vara de individuo a individuo?

Individuos no emparentados: una vez cada 103 pb. Principalmente en el ADN no codificante. ADN no codificante es aprox. el 70% del genoma. Presentes en el 1% de poblacin: Polimorfismos. De stos polimorfismos surge lo que se conoce como marcadores genticos.

 Qu son marcadores genticos?

Segmentos de ADN con una localizacin fsica identificable y reproducible que pueden ser fcilmente rastreados y usados para construir un mapa cromosmico.
en mapeo gentico, y en la elucidacin de patrones humanos demogrficos ancestrales. en evolucin: divergencia de especies, de poblaciones etc.

Aplicacin

Estudios

 Los

polimorfismos de regiones codificantes tambin son importantes y tiles

Por su relacin con enfermedades y desordenes genticos. Causan alteraciones funcionales protena Consecuencia: cambios fenotpicos evidenciables y rastreables.

Cmo

se generan los polimorfismos?

Mutacin, Secuencias repetidas, Diferencias en un nucletido (SNPs), Insercin, Delecin, Recombinacin.

MINISATLITES

Evolucionan por mecanismos de larga escala como intercambio desigual. Igual que los microsatlites, evolucionan por unidad de repeticin.

Tambin se conocen como VNTRs variable nucleotide tandem repeats.

Se encuentran dentro o entre genes.

Las unidades de repeticin son pequeas: 50 > 200 pb.

 MINISATLITES

EL nmero de copias en tandem de cada secuencia varia en cada individuo Esta variacin se genera durante la recombinacin gentica cuando las unidades de repeticin no se alinean bien. Altas tasa de intercambio gentico sitios frecuentes durante la recombinacin.

Se utilizan como marcadores y son la base de la huella gentica o fingerprinting.

MINISATELITES EJEMPLO
Combinaciones de genotipos en seis individuos, para tres alelos VNTR, llamados A, B, C : AA, BB, CC, AB, AC, BC

MICROSATELITES

MICROSATELITES

STRs Singel Tandem Sequence Repeats Secuencias cortas y repetitivas de ADN (1 a 8 pb). Regiones no codificantes del genoma. La diferencia en la cantidad de repeticiones en determinados alelos para diferentes individuos, constituye la herramienta ms importante de identificacin forense y diagnstico ofrecida por los micro-satlites

Los polimorfismos de LONGITUD son los ms comunes en el ADN repetitivo, y pueden ser:
* Insercin: uno o ms nucletidos. * Delecin: uno o ms nucletidos.
Usualmente

MICROSATELITES

la insercin y la delecin ocurren segn el nmero de nucletidos de la repeticin, es decir por unidad de repeticin.

SIMPLES MICROSATELITES * Repeticiones contiguas e idnticas * Unidad repetitiva dinucletica, flanqueda por una secuencia de nucletidos diferente a la repeticin.

TCGATATATATATCAG

COMPUESTOS * Repeticiones contiguas diferentes, de baja heterogocidad, flanquedas por secuencias distintas a la repeticin.

TCGAAAATAAAAATACAG

COMPLEJOS Repeticiones de longitud y secuencia variable, con una alta tasa de mutacin.

TCGAAAGTAGAAAGTAGTCTC

MICROSATELITES

Los diferentes alelos se generan por el nmero de repeticiones

SECUENCIAS DISPERSAS

ADN moderadamente repetitivo Hay dos familias: LINES (Long interspersed nucleotide elements) y SINES (Short interspersed nucleotide elements) Representados en humanos por los elementos L1 y Alu respectivamente.

Se considera que son elementos retrotransponibles: pueden replicarse va una copia de ARN reinsertada como ADN mediante transcripcin reversa. Papel en funcin genmica y en evolucin.
Posiblemente tiene un origen proviral, especialmente los LINES: retrovirus insertado en el genoma que qued inactivo.

Pruebas de Filiacin

Qu son las pruebas de filiacin y para qu sirven ?

Serie de pruebas biolgicas destinadas a realizar la identificacin de uno de los progenitores, partiendo del estudio del otro y del hijo cuestionado, abuelos, presuntos tos, identificacin materna, presuntos hermanos paternos biolgicos. Establecer relaciones familiares y paternidad en casos de delitos como la violacin, el aborto, el cambio de bebe en los Hospitales, el secuestro y la identificacin de restos humanos entre otros.

Tarjetas FTA
Matriz cargada positivamente No hay cuantificacin.

rea de extraccin

Calidad y aseguramiento

Equipo de proteccin

Cabina de flujo laminar Pipetas debidamente calibradas y uso de puntas anti-aerosol

Trabajo en parejas

Cmo se detectan las Short Tandem Repeats (STRs) microsatlites ?

DNA cadena templado
AATG

Forward primer
7 repeats

Reverse primer

8 repeats

Amplificacin con sets de primers especficos en multiplex P C R

195 bp

170 bp

TCAT repeat unit

Diferentes sets de primers generan difentes productos de PCR

Cules son las caractersticas de la PCR multiplex para microsatlites ?

Amplifica hasta 16 marcadores a la vez Niveles de sensibilidad > 1 ng of DNA Diferentes Fluorescencias Usadas para distinguir STR with rangos de tamaos que se sobrelapen.

ABI Prism 3100

Equipo analizador gentico

Electroforesis de capilar Set de 16 capilares

Cmo lee los amplificados en el equipo 3100 ?

Corrido electrofortico capilar, en acrilamida, Determinacin de perfiles Anlisis de bandas por tamaos y fluorescencia

Electroforogramas Con ladder

Power Plex 16 Genotipificacin (mujer)

Genotipificacin (trio)

3 sistemas genticos, uno exclusin

Cmo se determinan los AOPs ?

Presunto padre: Madre: Hijo: 11, 12 13, 14 12, 13
AOP = 12

Comparando los alelos del hijo con los de la madre, se establece el alelo heredado de la madre y por descarte el paterno

Por qu se requiere de clculos estadsticos ?

DIVERSIDAD POBLACIONAL

Cada grupo tiene diferente frecuencia de sus alelos

Poblacin de Referencia Muestreo poblacional

13 Loci STR

La frecuencia de los alelos de un sistema son tpicas para cada poblacin

STRs Frecuencias allicas

45 40 35 30
Frequencias HUM-TH01

25 20 15 10

Pob. Caucasica Pob. negra Pob. Hispanicas

*Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34

5
0 6 7 8 9 9.3 10
Alelos: # de repeticiones

En qu consiste el Cotejo de paternidad ?

Que tan probable es que sea el padre una vez se ha demostrado que posee todos los AOPs.

ADN

Contrastar los resultados obtenidos con dos hiptesis

CALCULOS PROBABILISTICOS
SI HAY NO EXCLUSION SE REALIZAN

La primera hiptesis: X Es que ese trio o ese caso sea verdadero. La segunda Hiptesis: Y Asumimos que el padre puede haber sido otro individuo dentro de la poblacin que tenga el mismo alelo obligado paterno, del individuo que estamos analizando.

Cmo encontramos el X ?
Asumimos un cruce mendeliano: PP MADRE HIJO D8 10,11 13,13 11,13

13

10,13

13

11,13 11 10

Posibles Hijos de esta pareja: 10, 13 11, 13 10, 13 11, 13

Cmo la encontramos Y ?
D8
PP 10,11 MADRE 13,13 HIJO 11,13 AOP 11

Y = 1(frecuencia del AOP, dentro de la poblacin).

INDICE DE PATERNIDAD
Indice de paternidad IP = X / Y Probabilidad de paternidad W = X/(X+Y) X: probabilidad de que el presunto padre sea el padre del menor en cuestin

Y: Probabilidad de que el presunto padre sea cualquier individuo tomado al azar en la poblacin

Cmo se informan los resultados ?

NO EXCLUSION Se observa que PP posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debera tener el padre biolgico de la menor H. Se calcul entonces la probabilidad que tiene de ser el padre biolgico comparado con otro individuo tomado al azar en la poblacin de la regin Andina de Colombia. CONCLUSIN: PP no se excluye como el padre biolgico de la menor YYYYYYY. Probabilidad de Paternidad: 99.99999%. Es 26658202,74 veces ms probable que XXXXX sea el padre biolgico de la menor H a que no lo sea. EXCLUSION Se observa que PP no posee todos los alelos obligados paternos (AOP) que debera tener el padre biolgico de la menor H en DOCE (12) de los sistemas genticos analizados: D21S11, HUMCSF1P0, D3S1358, HUMTH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, HUMVWA31, D18S51, D5S818 y HUMFGA. CONCLUSIN: PP queda excluido de la paternidad de la menor H.

Cules son los casos que normalmente se procesan para pruebas de filiacin ?
Casos simples: PP, M, H Presunto Padre fallecido - ADN extrado de sus restos seos.

Determinar todo los posibles genotipo de un hijo de esta pareja de presuntos abuelos paternos

Posibles hijos

Caso complejo: PP no disponible. Presuntos Abuelos Paternos, Madre, Hijo

Deducir el perfil gentico del presunto padre con los AOPs de los hijos reconocidos.
Caso complejo: PP no disponible. Disponibles los hijos reconocidos del PP, Madre, Hijo
Perfil gentico del PP

Caso complejo: Ausencia de uno de los progenitores.

Clculo de un ndice de paternidad comparando nicamente la frecuencia de los alelos compartidos padre-hijo.

Resultados PRUEBA DE Paternidad DNA TEST

ndice de paternidad o maternidad

Caracteristicas deseables de los STRS en la identificacin Forense

CASO
Planteamiento del Problema:
Establecer la filiacin entre una hija demandante con un presunto padre, se cuenta con madre biolgica.

RESULTADOS STRs AUTOSMICOS

AOP

PROBABILIDAD DE PATERNIDAD

CONCLUSIN
Con los resultados obtenidos del anlisis de los STRs autosmicos no es posible excluir al presunto padre (PP) de ser el padre biolgico de la hija H.
IP acumulado es de : 127. 545,0257 W(Po:0.5) = 99.9992 % IP: Indice de Paternidad W: Probabilidad de Paternidad

Probabilidad de Paternidad - PW
SI HAY NO EXCLUSIN: la PW debe llegar a 99.99%, (considerando el valor de creencia a priori de paternidad 0.5)
SI HAY EXCLUSIN: Mnimo tres exclusiones, siempre se repiten el proceso desde la extraccin de ADN. No hay necesidad de hacer clculos de IP y/o PW.

RELACIN DE IP Y W

Un IP de 1000, implica una probabilidad de 99,9%, un IP de 10000, implica un W de 99,99%.

EN GENERAL EL GRAN RETO DE LA PRUEBA EN GENTICA FORENSE ES LA CORRECTA VALORACIN DE LA PRUEBA, SU CORRECTA COMUNICACIN A LOS TRIBUNALES Y EL CORRRECTO ENTENDIMIENTO POR ESTOS DEL SIGNIFICADO DE LA PROBABILIDAD

Angel Carracedo

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)

Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)

Definicin: Los SNP o polimorfismos de un solo nucletido.

Este cambio puntual en una base del ADN puede presentarse por: Sustitucin, insercin o delecin.

Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la poblacin para ser considerada como un SNP.
Se estima que existen 5 millones de SNPs reportados y 4 millones validados a lo largo del genoma (Sobrino et al., 2005).
International HapMap Project

Cules son las Caractersticas de los SNPs?

1.

2.

3.

4.

5.

Los SNP son muy abundantes en el genoma humano y son la base de la individualidad gentica. Presentan un mayor potencial que los STRs para el desarrollo de sistemas mltiplex. Su anlisis permite aumentar el poder de discriminacin. Son muy convenientes para el anlisis en equipos y plataformas de alta tecnologa. No presentan el fenmeno de bandas stutters, por lo que permite discriminar mas fcilmente si una muestra es de origen nico o proviene de una mezcla.

Dnde se localizan los SNP?

Genoma Humano

SNP cromosoma Y SNP autosmicos SNP ADN mitocondrial regin codificante y regin control

Para qu sirven de los SNPs?

Gentica Medica: Diagnstico de enfermedades y respuesta farmacolgica para tratamiento con medicamentos - cncer, la artritis, Alzheimer, diabetes, las enfermedades autoinmunes o las cardiovasculares. Alzheimer: gen para la apolipoprotena E (ApoE). Contiene dos SNPs que resultan en tres posibles alelos que son: E2, E3, y E4. Cada alelo difiere por una base y el producto de cada alelo difiere por un aminocido. Cada individuo hereda un alelo de ApoE de la madre y otro del padre. Individuos que heredan al menos un alelo E4 tienen una alta probabilidad de padecer la enfermedad.

Aplicaciones de los SNPs

Gentica Forense: Anlisis de SNPs de cromosoma Y (Ej. mezclas en casos de delitos sexuales), SNPs de ADN Mt (til en muestras degradadas como restos seos antiguos, pelo sin bulbo, muestras con escaso DNA, alto numero de copias de ADNmt por clula). SNPs Autosmicos pruebas de paternidad o identificacin humana. Gentica de Poblaciones: Las mutaciones son grabadas en la molcula y transferidas de generacin en generacin como una huella gentica en la historia de la evolucin. Haplotipo de ADNmt: Secuencia de marcadores o alelos en un mismo cromosoma. Haplogrupo de ADNmt: Grupo de haplotipos que tienen un mismo motivo (motif) y comparten un ancestro comn.

Por qu es importante el ADN Mitocondrial en identificacin humana?

Regin Control (No codificante) Regin Codificante

HV I
16024-16365

HV II
73-340

Es una molcula Posee 16.569pb.

circular

Se localiza dentro de la matriz de la doble membrana de la mitocondria.

Por qu es importante el ADN Mitocondrial en identificacin humana?

La Regin Control es responsable de la regulacin de la replicacin y transcripcin. La regin codificante es donde se encuentran todos sus genes y mide 15.447pb.

Transmite lnea materna

Alta tasa de mutacin:5-10 veces mayor que el ADN nuclear

No recombinacin
Usualmente varan entre el 1-2% de las secuencias de ADN mitocondrial de individuos no relacionados en esa regin hipervariable Alto nmero de copias por clula: 250-1000

Por qu es importante el ADN Mitocondrial en identificacin humana?

Investigacin biolgica de la maternidad Criminalstica: el rendimiento del estudio de ADN mitocondrial frente al nuclear en el caso de muestras difciles es manifiestamente superior debido a su mayor cantidad y a la ms elevada posibilidad de que alguna copia est conservada. Identificacin de restos humanos y razas Los SNPs son detectados comparando la secuencia de la Regin Control que interesa con la Secuencia de Referencia de Anderson (1981)

SNPs de ADN Mitocondrial

Amplificacin y Secuenciacin directa de los fragmentos de inters

ADN mitocondrial: Interpretacin y valoracin de resultados

ADN mitocondrial: Interpretacin y valoracin de resultados - Heteroplasmia:

El ADNmt se hereda exclusivamente por va materna, en un individuo cabe esperar un nico tipo de ADNmt, sin embargo esto no es as siempre y por el contrario a lo que cabra esperar podemos encontrar individuos en los que coexisten ms de un tipo de ADNmt. A este fenmeno lo denominamos heteroplasmia

La teora de bottleneck o cuello de botella

La teora de bottleneck o cuello de botella

Un nmero de genomas de ADNmt se reduce a un nmero relativamente pequeo durante un paso de la oognesis. Este subgrupo de la poblacin de molculas de ADNmt es trasmitida por el proceso de bottleneck, y esta poblacin fundadora se replicar hasta producir aproximadamente 100.000 copias de ADNmt en el vulo maduro. Este subgrupo, podra por tanto, contener una poblacin homognea de molculas de ADNmt o una poblacin heterognea de genomas mitocondriales. La mezcla transmitida puede manifestarse presentando diferentes proporciones entre las distintas poblaciones de genomas mitocondriales para distintos descendientes y/o a lo largo de diferentes genes

La secuencia de una muestra problema es inequvocamente diferente de una muestra de referencia, es decir, al menos se presentan dos puntos de discrepancia diferentes, en este caso podemos excluir que el cabello proceda del sospechoso.

Ambas muestras presentan numerosas discrepancias con respecto a la secuencia de Anderson, concretamente 6 para MD y otras 6 discrepancias para MR, a su vez entre las muestras MD y MR existen 8 puntos discrepantes entre ambas muestras.

La muestra dubitada, pelo (MD), como nuestra muestra de referencia, sangre del sospechoso (MR), presentan los mismo puntos de discrepancia con respecto la secuencia de Anderson y por tanto coinciden entre si nucletido a nucletido. En este caso no podemos excluir que dicho pelo pueda proceder del sospechoso. Ser obligatorio en este caso de coincidencia evaluar el peso de dicha coincidencia.

Mtodos para el Anlisis de SNPs

Pirosecuenciacin Plataforma LightCycler (Roche). Sistema Microarray DNA microarrays D-HPLC , Espectrofotometra MALDI-TOF. Genotipificacin TaqMan (Applied Biosystems) Anlisis de Curvas Melting usando DASH. Deteccin de Productos de extensin de Primer basada en Electroforesis tales como: SNaPshot.

Anlisis de SNPs

Primer Extension Analysis: SNaPshot kit

1. Se basa en el uso de primers especficos (sin marcar) adyancentes a la base a determinar.
SNP

Primer

Molde

Figura 1. Diseo de Primer para SNaPshot.

Primer Extension Analysis: SNaPshot kit

2. Se realiza una reaccin de PCR slo con los 4 dideoxinucletidos (ddNTP) marcados cada uno con un fluorocromo diferente sobre el molde de DNA previamente amplificado y purificado (pueden ser uno o varios los moldes a analizar en una sola reaccin de SNaPshot)

DNA MOLDE PURIFICADO

Figura 2. Reaccin de Primer Extensin (Kit SNaPshot).

Primer Extension Analysis: SNaPshot kit

3. La deteccin de la base incorporada revela la presencia/ausencia de polimorfismo y el genotipo.
Color=Genotipo

Azul: G

Rojo: T
Verde: A Negro: C