ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP

Disciplina: Engenharia Bioqumica II A Programa de Aperfeioamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Prof Arnaldo Mrcio

Etapas de um Processo de Purificao

Etapa do processo

Operaes unitrias
Filtrao convencional Centrifugao Filtrao tangencial (membranas) Floculao H omegeneizao Ultra-som Moagem em moinho de bolas Rompimento qumico ou enzimtico Precipitao

Princpio
Tamanho de partculas Tamanho e densidade de partculas Tamanho de partculas Hidrofobicidade de partculas Cisalhamento Cisalhamento Cisalhamento Hidrlise, solubilizao ou desidratao de molculas que compem a parede ou a membrana celular Solubilidade Massa molar e raio hidrodinmico de molculas

Clarificao

Rompimento de clulas

Purificao de baixa resoluo

U Itrafiltrao (membranas)

Extrao em sistemas de duas fases lquidas Solubilidade, massa molar Cromatografia de troca-inica Cromatografia de afinidade (biolgica ou qumica) Cromatografia de imunoafinidade

Purificao de alta resoluo

Cromatografia de interao hidrofbica Cromatografia de excluso molecular Membranas adsortivas Cristalizao

Tipo e densidade de carga na superfcie da biomolcula Stios especficos da superfcie de uma protena (adsoro) Stios especficos da superfcie de uma protena (adsoro antgeno/anticorpo) Hidrofobicidade
Massa molar Massa molar e caractersticas para adsoro ou stios especficos da superfcie de uma protena Solubilidade e caractersticas de equilbrio lquido-slido Caractersticas de equilbrio lquido-slido Caractersticas de equilbrio lquido-slido

Tratamentos finais

Liofi I izao Secagem

Rompimento Celular
Rompimento Celular Clarificao

Suspenso Celular

Produtos Intracelulares
Produtos intracelulares tornam o processo de purificao de biomolculas mais difcil

em comparao com produtos extracelulares devido necessidade do rompimento

 Aplicados aps a separao e lavagem das clulas;

Clulas animais (possuem apenas membrana), fcil

rompimento com baixa fora de cisalhamento;

Ex.: Clulas animais: rompidas por simples variao da

presso osmtica do meio, adio de detergentes ou aplicao de ultra-som de baixa intensidade

Forma mais adequada de Rompimento?

Tipo de microrganismo Tamanho da clula; Tolerncia a tenses de cisalhamento; Necessidade de controle de temperatura; Gasto de energia;

Parede Celular

Mtodos de Rompimento Celular

Mecnicos Nomecnicos Qumicos
Enzimticos
Homogeneizador de alta presso Moinho de bolas Ultrassom

Choque osmtico Congelamento-descongelamento Aquecimento Secagem

lcalis Solventes Detergentes cidos

Lize enzimtica

Homogeneizador a alta presso

Cavitao Turbulncia Cisalhamento

Mecnico - Homogeneizador a alta presso

Este tipo de rompimento provoca aumento da

temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigerao

Presses utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi,

velocidades de alimentao da ordem de 180 a 280 m/s e concentraes celulares de 450 a 750 g/L (massa mida).

Mecnico - Homogeneizador a alta presso

O desempenho pode ser afetado por:

Presso de operao; Velocidade de alimentao; Temperatura; Estado fisiolgico do microrganismo; Condies de cultivo; Tipo de clula e sua concentrao.

tamanho das clulas (maior => rompimento mais fcil)

presso (maior => maior eficincia)

nmero de passagens (mltiplas etapas aumenta o ren-

dimento)

Existe um modelo matemtico para avaliar o rompimento, que neste caso de 1a ordem em relao ao nmero de passagens e de potncia em relao presso de trabalho:

log onde:

Rm = (Rm R)

k . N . Pa

Rm a concentrao mxima de protena disponvel para ser liberada (g/L) R a concentrao de proteina liberada (g/L) k a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de clula N o nmero de passagens P a presso a constante que depende do tipo de microrganismo e das condies de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

Mecnico Moinho de Bolas

Consiste na passagem da suspenso celular por uma

cmara de triturao (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitao e preenchida com esferas de vidro.
O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento

aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das clulas.

Mecnico Moinho de Bolas

Mecnico Ultra-som
O rompimento ocorre quando ondas sonoras

(~20kHz), so convertidas em vibraes em um meio lquido e causam o fenmeno de cavitao.

Escala de laboratrio.

Mecnico - Ultrassom

Rompimentos Mecnicos
Desvantagens:
As elevadas foras de cisalhamento provocadas pelos

rompimentos mecnicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas;

Com o rompimento integral das clulas todo o contedo

intracelular, incluindo cidos nuclicos, organelas e fragmentos celulares liberado junto com a molcula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.