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MICROPROPAGAO

INTRODUO

Em

1902, Haberlandt totipotncia celular;

postulou

Esta idia, associada com a hiptese do

balano hormonal, proposta por SKOOG & MILLER (1957), tem tornado possvel o estudo da morfognese in vitro e sua aplicao mais prtica, a micropropagao.

CONCEITO
Micropropagao o desenvolvimento de novas
plantas em um meio artificial sob condies asspticas, a partir de pequenos propgulos (explantes); Para as frutferas, as partes mais empregadas so pices caulinares, micro-estacas, embries, calos celulares; A cultura de tecidos difere dos mtodos tradicionais, a micropropagao emprega propgulos pequenos, controle assptico, controle do meio ambiente e rpida multiplicao das frutferas, quando comparada com os mtodos tradicionais.

FASES DA MICROPROPAGAO
A rpida multiplicao em cultura de tecido pode 1. 2.
ocorrer devido: A um aumento da formao de brotaes axilares, seguido do enraizamento individual destas brotaes; produo de brotaes adventcias, tambm seguida de enraizamento destas brotaes; embriognese de clulas somticas. DEBERG & MAENE (1981) enfatizam que cinco fases so importantes para a micropropagao eficiente de uma espcie, sendo elas:

3.

ESTDIO 0: FASE PREPARATIVA


Esta fase compreende o cultivo das matrizes em
condies especiais de higiene;

Deve-se ter plantas matrizes crescendo em vasos

ou outros recipientes, em casa de vegetao com cobertura de vidro ou plstico;

No se deve fazer uso da irrigao por asperso,


mas fornecer gua para as plantas diretamente no vaso por capilaridade.

ESTDIO 0: FASE PREPARATIVA (cont.)


O impacto deste estdio inicial aparentemente no limita
somente a condio sanitria da planta, mas tambm a percentagem de sobrevivncia na fase seguinte; Recomenda-se, ao coletar o propgulo, desprov-lo de suas folhas para, em seguida, usar agentes esterilizantes. No entanto, as cicatrizes deixadas pela retirada das folhas tornamse uma porta aberta para a entrada de patgenos; Assim, empregando-se esta fase, pode-se desinfestar o material sem a retirada das folhas que contero um menor nmero de inculos, o que, conseqentemente, redundar em uma maior sobrevivncia. Alguns parmetros afetam sensivelmente a planta matriz de onde ser coletado o propgulo. Entre eles, podem ser citados:

LUZ

Os segmentos foliares provenientes de

plantas estoques (matrizes) tratadas com luz vermelha produzem mais brotaes por explante do que plantas no-tratadas.

TEMPERATURA

Tem sido mostrado que plantas lenhosas


podem ser induzidas a surtos de novos crescimentos quando colocadas em temperaturas de 4 a 5 C por um perodo de tempo equivalente quele necessrio para a quebra natural de dormncia.

PR-TRATAMENTO COM REGULADORES DE CRESCIMENTO


A reatividade do explante logo aps o estdio 0,
ou seja, no estdio 1, pode ser controlada por um tratamento apropriado com reguladores de crescimento da planta estoque, das fontes de explantes ou prprio explante. Manipulaes podem mudar a fisiologia das estacas de rvores velhas, de tal forma que elas se tornam propcias para uma propagao clonal comercial. Embora til para a propagao comercial, os propgulos no se comportam de forma juvenil semelhante aos seedlings.

ESTDIO 1: INCIO DO CULTIVO


A finalidade deste estdio iniciar o cultivo
ascnico. Nesta fase, deve ser dada ateno para: EXPLANTE: a escolha recai geralmente nas gemas apicais ou axilares. O estdio de desenvolvimento do explante de suma importncia. A idade da planta matriz, a idade fisiolgica do explante ou seu estdio de desenvolvimento, assim como seu tamanho, podem determinar o sucesso deste procedimento.

REAES DE HIPERSENSIBILIDADE: Quando os

tecidos so expostos a condies de estresse, o metabolismo de compostos fenlicos estimulado. Isto leva a reaes de hipersensibilidade, tais como a liberao do contedo nas clulas danificadas, as reaes nas clulas vizinhas, mas, sem mostrar sintomas de danos, e/ou a morte prematura de clulas especficas no lugar do ferimento ou o lugar de infeco. De um modo geral, de acordo com RHODES & WOOLTORTON (1978), h trs tipos possveis de resposta ao estresse ou dano: Oxidao de compostos fenlicos pr-formados, ocorrendo a formao de quinonas e material polimerizado, sntese de monofenis e sntese de derivados de polifenis.

SNTESE DE MONOFENIS
Pode levar ao acmulo de maiores quantidades
de produtos pr-formados nos tecidos no danificados ou ao aparecimento de novos produtos que desempenham um papel no mecanismo de proteo do tecido contra a contaminao (fitoalexinas). O papel destes produtos j mencionados pode ser o de formar uma barreira fsica contra a invaso (lignina), ou um inibidor de crescimento microbiano (quinonas, fitoalexinas).

COMPOSTOS FENLICOS
Um grupo especial de compostos fenlicos so as
auxinas protetoras (antioxidantes que inibem a oxidao do AIA catalizado pelas peroxidases). Numa planta intacta, h um gradiente na inibio da degradao enzimtica do AIA que inversamente proporcional idade do tecido. Isto mostra que a inibio diminui em direo base do caule, ou a concentrao de auxinas protetoras maior nas folhas mais novas e nos interndios. De um modo geral, os fenlicos so produtos facilmente oxidados. Tais produtos podem ser fitotxicos, ou mesmo aumentar os processos de oxidao, porque depois de ocorrer a oxidao, eles se tornam oxidantes muito fortes.

COMPOSTOS FENLICOS (cont.)

Pelo que foi visto, fica claro que, com

respeito ao cultivo de tecidos, os objetivos so de dois tipos: primeiro, deve-se tentar ter as auxinas protetoras dentro do tecido para estimular o crescimento; aps, devese limitar a biossntese de compostos fenlicos, ou quando eles so liberados no meio de cultura, deve-se aumentar o perodo necessrio para iniciar sua oxidao.

COMPOSTOS FENLICOS (cont.)

GEORGE & SHERRINGTON (1984) mostram alguns passos para se evitar o escurecimento do tecido e do meio, na fase 1 da micropropagao:

1. Remoo dos compostos fenlicos produzidos (lixiviao,

2.
3.

4.
5.

adsoro com carvo ativado ou polivinilpirrolidona); Modificao do potencial redutor (agentes redutores ou menos oxignio disponvel); Inativao (agentes quelantes) ou reduo da atividade da enzima fenolase (baixo pH, escurido, entre outros). Nem todo antioxidante eficaz nesta fase (o cido ascrbico); O mangans (Mn++, um cofator de peroxidases) e o cobre (Cu++, parte da complexa enzima fenolase), podem estimular a oxidao de fenis.

ESTDIO 2: MULTIPLICAO
Nesta fase, cultivam-se brotaes com a finalidade de
aumentar o nmero de estacas. Aqui, podem ocorrer inmeros subcultivos at atingir um nmero de brotaes que sero enraizadas. Pretende-se, nesta fase, obter brotaes alongadas e aptas para a fase de enraizamento; Para a maioria das frutferas, o mtodo mais usado o da formao adventcia de caules (facilita grandemente e de forma rpida o aumento de propgulos); Para cada espcie, no entanto, tem-se que determinar se este sistema produz plantas com as mesmas caractersticas genticas da planta-me; A calognese axilar tambm empregada na micropropagao e garante a obteno de indivduos com idntica composio gentica da planta matriz.

Figura 1: diagrama da produo de mudas advindas da micropropagao de gemas terminais e axilares.

ESTDIO 2: MULTIPLICAO (cont.)


Nessa fase, uma dosagem excessiva de citocinina
ou a escolha inadequada de uma citocinina poder ser responsvel pelo aparecimento de plantas epigenticas que s podero ser avaliadas no final do processo; RANCILLAC et al (1987) observaram que um nmero elevado de subcultivos do morangueiro in vitro resulta em srios distrbios, tais como ausncia ou fraco enraizamento, formao excessiva de flores, frutos pequenos e deformados e plantas heterogneas.

ESTDIO 3: ALONGAMENTO E INDUO DE RAIZ OU DESENVOLVIMENTO


Nem sempre o alongamento das brotaes necessrio. s
vezes, a simples transferncia das brotaes para um meio com ausncia de citocininas o suficiente para causar alongamento. A auxina o regulador de crescimento utilizado na fase de induo de razes; As auxinas mais amplamente utilizadas nesta fase so: AIB (cido indolbutrico). AIA (cido indolactico) e ANA (cido naftalenactico). A etapa aps a induo radicular a iniciao radicular, que geralmente no precisa ocorrer em presena de auxina; McCOMB & NEWTON (1981) sugeriam o emprego de substratos inertes para esta fase de enraizamento, ao invs do gar comumente empregado.

ESTDIO 4: TRANSFERNCIA PARA AS CONDIES DE CASA DE VEGETAO


As plntulas que durante todo o tempo cresceram em

condies totalmente artificiais, agora passam para condies naturais (FASE CRTICA); Essa mudana, por ser brusca, deve ocorrer paulatinamente: - As folhas das plantas micropropagadas apresentam uma menor quantidade de ceras epicuticulares que, associada pouca funcionabilidade dos estmatos, as torna suscetveis a grandes perdas de gua por transpirao (1 a 2 semanas sombrite e nebulizao em casa de vegetao ou telado).

PRODUO DE FRUTFERAS LIVRES DE ENFERMIDADES

As frutferas de um modo geral so


propagadas vegetativament(clones);

Problema: vrus, o que leva a uma queda


contnua na produtividade;

A limpeza clonal ocorre com o emprego de


tcnicas tais como:

TERMOTERAPIA
As plantas matrizes ou estoques so colocadas
em ambiente com temperatura elevada, geralmente acima de 30C (varia de acordo com a espcie e variedade) por um perodo mnimo de 20 dias, mas, preferivelmente, acima de 40 dias. Este tempo necessrio para inativar o vrus ou micoplasma presente na planta; Concomitantemente, ocorre crescimento das brotaes da planta estoque, que provavelmente no acusaro a presena do vrus; Estas brotaes so ento retiradas e podero, aps o enraizamento, servir de fonte de material vegetativo livre de vrus.

CULTURA DE MERISTEMA
Neste caso, faz-se a retirada do meristema,

tecido de gemas vegetativas, terminais ou axilares; Este tecido transferido para um meio de cultura contendo reguladores de crescimento, onde, atravs do processo de diferenciao, ocorrer a formao de brotaes que seguiro as etapas j mencionadas anteriormente.

Figura 2: Diagrama da cultura de meristema: a limpeza clonal poder ser obtida no final deste processo.

TERMOTERAPIA SEGUIDA DE CULTURA DE MERISTEMA

Este processo um dos mais seguros para

se obter a limpeza clonal. As plantas passam por um perodo de termoterapia que se sucede retirada do meristema, o qual inoculado em um meio de cultura semelhante ao anterior.

MICROENXERTIA
Este processo empregado para aquelas
espcies que no podem ser submetidas a temperaturas elevadas e, principalmente, para as espcies que, ao serem multiplicadas in vitro, apresentam uma reverso ao estdio de juvenilidade. Neste caso, o meristema coletado enxertado em porta-enxerto crescido in vitro; Este processo apresenta um baixo rendimento; comumente empregado para os citrus, podendo tambm ser usado para a cultura da ameixeira e pessegueiro.

Figura 3: Diagrama da tcnica de microenxertia in vitro para obteno de plantas isentas de vrus e micoplasmas.

OBRIGADO