Unidad

I
Estructura
bioquímica de los
ácidos nucleicos
ácidos nucleicos

son las moléculas que determinan

lo que es y hace cada una de las
células vivas
ADN polímero especializado en
almacenar y transmitir la información
genética (huella genética)

ARN - molécula intermediaria

responsable de transcribir la información
genética para convertirla en proteínas.
La información genética que determina todas las
características de una especie se encuentra contenida en
todas sus células (Genoma).

Por lo general, nos referimos al ADN contenido en el núcleo,

organizado en cromosomas. Sin embargo, también debemos
incluir el material genético presente en mitocondria y en
cloroplastos.
Transcripción

Procesamiento post
transcrpcional

Traducción

Maduración
 Dogma central de la biología
molecular
• A partir del ADN se sintetiza ARN y a partir del ARN se sintetizan
proteínas

• El ADN puede replicarse y, por tanto, reproducirse para transmitir la

información genética a la descendencia
 Polímero de Polímero de
Polímero de
nucleótidos de nucleótidos en
aminoácidos
doble cadena cadena sencilla
 Replicac
ión DNA

Transcripció
n

Transcripción reversa

Traducció
n

Proteín
a
 componente
s
Estructuralmente son cadenas poliméricas de nucleótidos*
unidos covalentemente unos a otros en arreglos definidos
(secuencias).
Base
P nitrogen
ada
enlace nucleótidos*
azúc glucosídico unidades mínimas que
ar conforman los ácidos
enlace
nucleicos
fosfodiester Base azúcar (5 C) + molécula
P nitrogen de fosfato + base
ada
nitrogenada
azúc
ar
Azúcar: Pentosa
(5C)
ARN

Ribosa

2
Desoxiribos
ADN

a
Bases nitrogenadas (componentes variables)

PURÍNICA PIRIMIDÍ
S NICAS

Adenina Guanina Timina

Citosina Uracilo

A, G y ADN y ARN
C
T Solo ADN
U Solo ARN
 Enlace glicosídico:
Unión entre el C1 de la pentosa y el N en posición 1 (pirimidínicas) o
en posición 9 (purínicas) de la base nitrógenada

PIRIMIDÍNICAS

NUCLEÓSI
DO
PURÍNICAS 6

7 5 1
8 2
9 4 3
 Enlace fosfoéster

Unión entre el grupo OH del

C5 de la pentosa con el
grupo fosfato
ácido
fosfórico
+

nucleósido NUCLEÓTI
DO
2-desoxiriboadenosin-5-
monofosfato
Nucleósido

BASE + AZUCAR =
NUCLEOSIDO

Nucleótido

BASE + AZUCAR + FOSFATO = NUCLEOTIDO

Bases nitrogenadas

citosi
na adenin
uracilo a
PURIN
AS

guanin
timin PIRIMID a
a INAS
Azúcares (pentosas) β-D-
ribosa

azúcar de 5
carbonos

β-D-2
desoxirribosa
 Fosfatos
Unidos al grupo OH del C-5 del azúcar. Presentes como
mono, di o trifosfatos. El grupo fosfato confiere una
carga negativa al nucleótido.
adenosin monofosfato
(monofosfato de
adenosina)
Nucleótido
Subunidades mínimas de los ácidos base
nucleicos

fosfato

azúcar
La base esta
unida al mismo C
(C1) usado en las
uniones entre
azúcares.
Unión nucleótido -
nucleótido
Los nucleótidos se unen
entre si mediante el
enlace fosfodiester, a
través de los átomos de
la posición C5´ y C3´
para formar los ácidos
nucleicos.
Tarea

Investigar otras bases nitrogenadas

presentes en los nucleótidos de
algunos ácidos nucleicos

Modificaciones al dogma central de la

biología molecular (lunes)
ADN - historia

1868: Friedrich Miescher – primera extracción de

ácidos nucléicos

solución
Comprobó
alcalina su
NUCLEÍ presencia
NA en otros
tipos de
células

lavado de vendajes lisis celular y

(pus*) con solución salina precipitación
del núcleo

* Leucocitos = globulos
blancos
 1890: Albrecht Kossel - descubrió la existencia los carbohidratos y
de las bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina).
Premio Nobel de Fisiología y Medicina
(1910)

1911: Theodore Levene - demostró que carbohidratos eran

pentosas (ribosa o desoxirribosa), utilizando a partir de entonces los
nombres de ácido RIBONUCLEICO (RNA), y ácido
DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA). También descubrió que el RNA no
poseía timina, pero si uracilo.

1934: Levene aisló NUCLEOTIDOS (pentosa, base nitrogenada y

ácido fosfórico) a partir de ácidos nucleicos.

Década de los 40: Feulgen, Caspersson, Mirsky, Sager y otros

desarrollaron técnicas de tinción que permitieron estudiar la
localización celular de los ácidos nucleicos. DNA en el núcleo y RNA
repartido en el citoplasma. Se comprobó la existencia de DNA en los
cromosomas, viéndose una cantidad de DNA constante y propia de
cada especie. Surge la idea de que podría existir una relación entre el
DNA y los genes o factores hereditarios.
 1944: Avery, Macleod and McCarty - “Principio
transformante” confirmación de que el DNA portaba
información genética

X
X
Cepa X
virulenta
aislamiento
distintas fracciones
Cepa no
virulenta carbohidr lípid ARN proteína ADN
atos os s
transformació
n con
X
Cepa distintas
X
virulenta fracciones de
X
inactivada por células no
calor virulentas

X
X
?
X
no virulent
virulentas as
Cepa Cepa no
virulenta virulenta
inactivada
por calor
Experimento Fred
Grifith (1928)
1950s: Rosalind Franklin y Maurice Wilkins - comenzaron a elucidar la
estructura de ADN.

Difracción de rayos X de
ADN

 La molécula de DNA es una cadena extendida con

una estructura altamente ordenada

 Presenta forma helicoidal y está compuesta por dos

cadenas
1953: Francis Crick y James Watson presentaron el modelo
tridimensional de la estructura del ADN (doble hélice)

Premio Nobel de Fisiología y Medicina

(1962)
1955: Francis Crick presenta y defiende el “Dogma Central de la
Biología Molecular”
ADN AR Proteína
N

1957: Meselson y Stahl demostraron que la replicación del ADN es

semiconservativa
1959: Arthur
PremioKornberg descubre
Nobel de Fisiología la polimerasa (síntesis enzimática
y Medicina
(1959)
DNA)
Premio Nobel de Fisiología y Medicina
1961-65: Nirenberg,(1968)Khorana y Holley descifran el código genético.

1972: Primera clonación de un fragmento de ADN (Cohen y Boyer)

1977: SePremio
clona el primer gen humano*
Nobel en Química (1980)
1980: Métodos rápidos de secuenciación (Sanger)

Premio Nobel en Química (1993)

1983: Mullins inventa el PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

http://dnai.org/timeline/index.
html
 ADN – estructura
primaria
extre
mo 5´
• Se trata de la secuencia
de desoxirribonucleótidos
que conforman una cadena.
La información genética
está contenida en el orden
exacto de los nucleótidos.

•Esqueleto formado por un

arreglo de pentosas y fosfatos
de manera alternativa, a través
de un enlace fosfodiester.

• El enlace fosfodiester se
refiere a las uniones formadas
entre el C5 y 3 de la pentosa
con el grupo fosfato.
extre
mo 3´ • Cada molécula tiene una
orientación definida, por lo que
la cadena es 5´-> 3´.
 Estructura
secundaria
pento
sa

• En la naturaleza el ADN se base

s

encuentra en forma de dos

cadenas de nucleótidos. 5´ C G 3´
• Estas cadenas no son fosfat
o A T
idénticas sino
complementarias en el G C

apareamiento de las bases

A
T
nitrogenadas:
A -T
G-C 3´ 5´
• El arreglo de ambas cadenas A-T están unidas por dos
puentes Hidrógeno y C-G por
es en forma antiparalela, una tres.
cadena tiene orientación 5´-3´ A=
y su complementaria 3´-5´ T
G=
Reglas de Chargaff (composición de
bases en el ADN)
3.A=T en cualquier especie (G=C)
4.La suma de purinas (A+G) = suma de pirimidinas (C+T)
5.El % de C+G no es necesariamente igual al % de A+T
6.El contenido de GC o AT es única para cada especie
7.Independiente del tejido la composición de GC (AT)
siempre es la misma

G+C entre 25 y 75% diferentes especies de bacterias

proporción mas constante entre especies relacionadas
por ejemplo entre mamíferos encontramos 39 y 46%
 puente
de
hidrógen
o

1 vuelta =
3.4nm
10 pares de
bases  por
cada vuelta de
la hélice
esqueleto
pentosa-
fosfato

base

A-T están unidas por dos puentes de

hidrógeno y C-G por tres
2n
m
 la doble hélice
• Hélice constituida por dos
cadenas
•La hélice se enrolla hacia la
derecha (sentido de las manecillas
del reloj)
• Las dos cadenas corren en
direcciones opuestas
• Hay 10 pares de bases  por
cada vuelta de la hélice
• Las bases nitrogenadas están en
un arreglo perpendicular al eje en
1000 nucleótidos
la parte(pares dede
central bases) ≈ hélice 100 vueltas ≈
la hélice
0.3 µm largo
1 nucleótido ≈ peso molecular de 330
 Estructura tridimensional
Los grupos fosfato se unen a los azúcares y se proyectan fuera
de la cadena.

ZURCO MENOR

ZURCO MAYOR
 Estructura
• terciaria
Formas de compactación del
ADN (torsión o enrollamientos)
• Importante en procesos de
empaquetamiento o
confinamiento celular así como en
la replicación
• Enzimas involucradas:
Topoisomerasas y girasas
relajad superenrolla
o do

Fotografía al microscopio electrónico de un DNA circular

relajado y con distintos grados de superenrollamiento
 REPETIDOS INVERTIDOS :
OTRAS FORMACION DE TALLO-ASA
EN CRUZ
ESTRUCTURAS
Doblamientos ligeros
ADN doble cadena con
repetidos de 5 adeninas
en la misma cadena

Función: regulación
genética, zonas de
interacción con
proteínas
 Tarea

Formas A, B y Z del ADN (martes)

Describir y explicar el experimento de

Hershey-Chase (lunes)
 Uracilo Dihidrouridina
(U) (D)

Guanina (G) 1-metilguanosina Inosina (I)

(m´G)
Bases nitrogenadas ligeramente diferentes de las bases
normales presentes en otros ARN, ya que se encuentran
frecuentemente metiladas.

Bases poco usuales

son la seudouridina,
inosina,
dihidrouridina,
ribotimina, metil
guanosina etc.

Estas modificaciones
son necesarias para
conseguir un ARNt
funcional.
 modificaciones al dogma central de la
biología molecular
elementos que implican la ampliación de este dogma:
priones, ribozimas y la enzima transcriptasa inversa
(RT).
Priones: proteínas libres de
ácido nucleico, se propagan en su
naturaleza polipeptídica,
simplemente afectan a proteínas
de su misma secuencia, Retrovir
previamente existentes, alterando us (RT)
su conformación. Las
enfermedades por priones
conocidas hasta ahora son fatales,
afectan al sistema nervioso y se
cree que también a los músculos.

Priones Ribozimas
síntesis in virus
vitro
Los retrovirus poseen dos
copias de un RNA. La
información genética
contenida en estos RNA
genómicos es copiada en
reverso para generar una
copia de DNA viral de doble
cadena, que se integra al
genoma o DNA celular, dando
origen a un mRNA y proteínas
virales. Para realizar el
proceso de síntesis de este
DNA viral o transcripción
inversa- es decir, síntesis de
DNA a partir de RNA-, estos
retrovirus poseen una enzima
DNA polimerasa RNA
dependiente, llamada
comúnmente La transferencia de información genética
transcriptasa
inversa. ocurre de acuerdo a:
i) RNA + ---> DNA - ---> DNA +
ii) DNA +- ---> mRNA ---> PROTEÍNAS
iii) DNA +- ---> RNA V
ADN – desnaturalización
Cuando la temperatura alcanza el
punto de fusión del ADN, la
agitación térmica es capaz de
separar las dos hebras y producir
una desnaturalización. Durante
este proceso se rompen los puentes
de hidrógeno que unen las cadenas
y se produce la separación de las
mismas (sin romper los enlaces
fosfodiester covalentes que forman
la secuencia de la cadena). La
desnaturalización puede ocurrir,
también por variaciones en el pH.

La desnaturalización es un proceso
reversible, ya que al bajar la
temperatura se puede producir una
renaturalización*.
 Efecto hipercrómico -
aumento en la
absorbancia en ADN de
cadena sencilla.
La separación de las
cadenas durante la
desnaturalización
modifica las
propiedades físicas del
ADN (absorción de luz
UV).

Una solución de ADN

(doble cadena) con una
concentración de
0.05mg/ml presenta
una absorbancia (DO) λ
1.0 absorbancia λ 260 ADN cadena doble = 50µ
260 de 1.0

g/ml
1.0 absorbancia λ 260 ADN cadena sencilla =
Temperatura de desnaturalización (Melting tempeture Tm) =
temperatura a la cual el 50% del ADN se encuentra en forma de
cadena sencilla (parcialmente desnaturalrizada).
Tm= 16.5(log[Na+] + 0.41(%GC)
+ 81.5°C

En función del contenido de

CG y del tamaño (número
de nucleótidos)
Tm en moléculas cortas y/o ricas en AT

Tm=2(AT) + 4 (GC)
Cálculo solo para moléculas de 15-30
bases

Ejemplo
-CGTATTACGATCCCAT
TGC-
AT=10
GC=9
Tm= 2(10) + 4(9)
=20+36 = 56°C
 ARN – estructura
primaria
Al igual que el ADN, se refiere al
arreglo (secuencia) de los nucleotidos
en la molécula

A diferencia del ADN:

• es una molécula de una sola cadena

• contiene URACILOS en vez de

timinas

• el azúcar es RIBOSA en vez de

desoxirribosa
 Estructura
secundaria

egiones en la misma cadena

con secuencias
complementarias capaces de
aparearse.

estructura de
horquilla
Tipos de ARN

RN MENSAJERO (ARNm)
cadena larga sencilla que incluyen en su secuencia la información que
se traduce en aa, es sintetizado a partir de un molde de ADN.

RN de transferencia (ARNt)
Son cadenas cortas (70 nucleótidos) dispuestos
en una secuencia única para cada aa.

RN Ribosómico (ARNr)
onstituyente esencial de los ribosomas, su función
es leer los ARNm y formar la proteína
correspondiente.
 ARNm

• Presencia de
Se asocian con algunas
intrones y exones
proteínas para prevenir
(según su grado de
formación de estructuras madurez)
secundarias y proteger de
• CAP en el
endonucleasas. Cola de
poliA extremo 5´ (mayor
Constituye el 5% de
resistencia a la
ARN total. hidrólisis)

• Cola poli A
(formada hasta por 250
residuos de adenilato)

procario eucariot
tas as
 ARNt
• Transporta los aa para la
síntesis de proteínas
• Presenta plegamientos
(bucles u horquillas) y puentes
de hidrógeno entre sus bases
complementarias
• Peso molecular ≈25 000Da
• Formado por 70 a 90
nucleótidos
• Constituye el 45% de ARN
total de la célula
• Se sintetiza en el núcleo y
sale hacia citoplasma para
estructura secundaria estructura terciaria
realizar su función
• En su estructura secundaria
se distingue el brazo aceptor
de aa abierto (extremos 5´ y 3
´) y un bucle anticodón (triplete
ARNr

• Elemento constitutivo de los ribosomas

• Comprende el 50% del ARN total
• Su estructura secundaria presentan
horquillas y bucles los cuales condicionan su
interacción con las proteínas
horquillas

tallos

estructura secundaria
El tamaño de una molécula de ARN se mide normalmente en razón de la
movilidad de la molécula cuando se la somete a un campo
centrífugo a alta velocidad. El método se denomina análisis de
sedimento zonal, y la velocidad de sedimentación se mide en
Svedberg, abreviadamente, S. Cuanto mayor es el ARN mayor es su S.
BACTERI EUCARI
A OTA

28S ARNr
(4700
23S ARNr nucleótidos)
(3200
nucleótidos)

16S ARNr 18S ARNr

(1540 (1900
nucleótidos) nucleótidos)
Resumen

ADN ARN
Almacén y transmisor de Intermediario entre el ADN y
información genética las proteínas
Mayor estabilidad Poca estabilidad (fácilmente
degradado por enzimas)
Cadenas dobles Cadena sencilla
(bicatenario) con (monocatenario)
morfología de hélice
Pentosa = desoxirribosa Pentosa = Ribosa
(carece de un O en el C-2), de ahí (OH en el C-2)
el nombre ácido
Bases nitrogenadas Bases nitrogenadas
Purinas = A y G Purinas = A y G
Pirimidinas = T y C Pirimidinas = U y C
En eucariotas En eucariotas en núcleo y
mayoritariamente en el citoplasma, también se
núcleo, también en encuentra en mitocondrias y
mitocondrias, cloroplastos y cloroplastos.
centriolos.
Empaquetamiento del ARN
ADN
VIRU proteína
S

Virus del mosaico del

tabaco
Fago filamentoso estructura linear
6400 nucleotidos
M13
Virus ADN de cadena sencilla
estructura linear
6400 nucleótidos

DNA cadena doble

ADN de ØX174
Virus ADN de cadena sencilla Bacteriofago
estructura circular
5400 nucleótidos λ
ADN doble cadena
estructura linear
48 514 bases
 PROCARIO
TAS Nucleína: Forma
característica de agregados
de DNA dentro de la célula

Detalle en microscopía.
Tinción nucleína en E.
Genoma bacteriano: molécula coli

circular cerrada y empaquetada

en una estructura
Genomas completos
superenrrollada en arreglos o
dominios estabilizados por varían entre 1000 y
proteínas específicas 9000 kilobases
Algunos datos

Diferentes cromosomas humanos - 3.2 X109 pb (3 200

000 000)
Organismos diploides - 6.4 X109 pb

A 34nm distancia entre bases

= 6 400 000 000 pb X (34nm) = 2.1m ADN total en

el núcleo

Tamaño núcleo = 5-10µm

Grado mayor de empaquetamiento (mitosis)
el ADN se contrae 10 000 veces
aproximadamente.
 EUCARIOT
El ADNAS
se enrolla (dos vueltas) alrededor
de un octámero de proteínas histónicas
formando un nucleosoma estos quedan
separados por secuencias de ADN de
hasta 80 pb, formando un "collar de +
perlas"  o más correctamente
denominado fibra de cromatina
Los nucleosomas se organizan, en
fibras de 30nm (solenoide), girando
a manera de resorte alrededor de un eje
virtual. Esta estructura es mantenida por
la interacción de las H1 de nucleosomas
cercanos.
En el siguiente nivel de
empaquetamiento, las fibras de 30nm se
organizan en una serie de bucles o
asas superenrolladas. Estos bucles se
estabilizan gracias a la interacción con
las proteínas de la matriz nuclear o
andamiaje nuclear
Continua el enrollamiento al grado de
mayor espiralización y
compactación, formando un denso
paquete de cromatina (un cromosoma)
 *Estas proteínas
básicas son ricas en
residuos de arginina y
lisina (cargados+). Por
esta razón se unen
estrechamente con los
P (cargados-) del ADN.

Los nucleosomas están formados por un centro o "core" de

histonas. Dicho centro posee dos copias de cada una de las
siguientes histonas: H2A; H2B; H3 y H4

Alrededor del centro de histonas, 146 pares de bases del ADN se

enrollan en dos vueltas. La unión de las histonas al ADN no
depende de una secuencia particular de nucleótidos, sino de la
Genes, cromosomas y
genomas
Un gen es una secuencia lineal de
nucleótidos (4kb) en la molécula de ADN
que contiene la información necesaria
para la síntesis de una macromolécula con
función celular específica (ARN mensajero
-proteína, ARN ribosómico o de
transferencia).

Es considerado como la unidad de

almacenamiento de información y unidad
La cantidad aldetransmitir
de herencia información codificada en miles de genes
esa información
presentes en una sola molécula de ADN requiere
a la descendencia.
necesariamente de una organización. En los eucariotes, este
primer nivel de organización es el cromosoma.

Los genes se disponen, a lo largo de los cromosomas, este

arreglo facilita la recombinación y la diversidad genética. Cada
gen ocupa en el cromosoma una posición determinada llamada
locus. El conjunto de cromosomas de una especie se
1. En eucariotas, entre especies existe una gran variación de
la cantidad de ADN presente en la célula
Mayor complejidad mayor tamaño

2. En todas las células existe una gran cantidad de ADN del

cual se desconoce su función.

Genoma Tamaño Número de

aproximado cromosomas
Escherichia coli (millones
4.64 de (haploide)
-
pb)
Saccharomyces 13 16
cerevisiae
Homo sapiens 3 400 23
Aphiuma sp 76 500 14
(salamandra)
Arabidopsis thaliana 167 5
Oryza sativa (arroz) 430 12
Zea mays (maíz) 4500 10
 Organización de los genes en un cromosoma
humano
Comprende el
1.5% del genoma.
Región rica
secuencias
repetidas de DNA

Obscuro - genes
identificados
Claro – posibles
genes

Rojo – exones
(codificantes)
Gris- intrones
 tamaño, forma y número de
cromosomas en microorganismos
cromosoma
organismo comentario tamaño
(pb) númer forma
o
Bacteria
Mycoplasma neumonía 7.8 x 105 1
penumoniae gram-neg , vías
Haemophilus
influenzae respiratorias 1 830 137 1
Escherichia coli gram-neg,
modelo genético 5.0 x 106 1
Archae crece altas
Thermococcus celer temperaturas 1.9 x 106 1
Haloferax mediterranei crece alta 2.9 x 106 1
concentración de
sal
Methanococcus voltae metanógeno 1.9 x 106 1

Eucariota
(unicelulares) Gastroenteritis 1.2 x 107 4
Giardia lamblia aguda
Saccharomyces Uso industrial y 12 057 16
cerevisiae científico 500
Tetrahymena Protozoario 2.1 x 108 5
thermophila ciliado
Comparación en tamaño de genomas
METODOS

Aislamiento de ADN total

(genómico)
1.Lisis – liberar el ADN del núcleo
2.Extracción – eliminar macromoléculas
y proteínas asociadas al ADN
3.Precipitación* - recuperación del
ADN

* reacción química en la
cual a partir de un
líquido se obtiene un
sólido
La elección del protocolo a utilizar
depende de varias consideraciones:

2)De qué material voy a partir para hacer la

extracción:
(tejido vegetal hoja, raíz, semilla; tejido animal ,
sangre, cultivos celulares, bacterias)

2) Para que voy a utilizar después mi ADN:

(PCR, bibliotecas genómicas, hibridaciones etc)

3) Me interesa considerar el rendimiento, el

tamaño promedio de fragmentos obtenidos y la
pureza
Extracción ADN

separación de precipitación secar y

lisar células
proteínas y ADN con resuspender
liberar ADN del
restos isopropanol menor
núcleo
celulares (etanol) en volumen
presencia de posible
Na+, K+ o NH4+

centrifugaci centrifugaci centrifugaci

ón ón ón

Extracto crudo
(proteínas ,
DNA, RNA,
lípidos y Eliminación de
carbohidratos)
sales con lavados
Bacterias – lisozima + Precipitación de
de etanol al 70%
EDTA Plantas y hongos proteínas con
– daño mecánico o cloroformo o
enzimas fenol*,
Células animales - eliminación de
detergentes RNA con Rnasas,
despolarizar tratamiento con
Extracción ADN -
plasmídico
Desnaturalización alcalina

fragmentos
desnaturaliza renaturalizac
cromosomal cion
es ion

plásmido

Plásmido Plásmido vuelve al

DNA cromosómico estado
en fragmentos desnaturalizado
permanece covalentemente
lineares, DNA cerrado mientras los
plasmídico en asociado mientras
los fragmentos fragmentos
círculo cerrado cromosomales se
covalentemente lineares se
disocian agregan y son
fácilmente separados
por centrifugación
Extracción ARN total

lisar células
Reactivo de precipitación resuspender
lisis: Fenol, Cloroformo ARN con menor
guanidina o (separación de isopropanol en volumen
tiocianato de proteínas) presencia de posible de
amonio y Na+ agua con DEPC
agentes
solubilizantes

centrifugaci
ón centrifugaci
ón
Tomar el
sobrenadante
(fase acuosa –
RNA)
Eliminación de
sales con lavados
de etanol al 75%
Pureza y cuantificación de ácidos
nucleicos por absorción en el espectro
UV
ADN o ARN: λ 260 nm purinas y pirimidinas
Proteínas: λ 280 nm aa aromáticos – tirosina, triptofano y
fenilalanina

RELACION 260:280 = 1.8 -

2.0
≠ contaminación proteínas
1 DO (λ 260nm) = 50µg/ml
ADN
1 DO (λ 260nm) = 44µg/ml
ARN

Para que estas relaciones sea

valida las lecturas de
absorbancia deben ser mayores a
0.15
Ejemplo:

1. Volumen de ADN muestra = 100µl

2. Dilución para realizar lectura 1:50

10µl muestra + 490 µl de buffer*

3. Medir absorbancia de la dilución a λ 260nm

DO = 0.2

4. Concentración de la muestra = 50µg/ml x DO x

factor de dilución
= 50µg/ml x 0.2 x 50
= 500µg/ml

* Buffer con pH neutral (Tris.Cl 10mM

pH=7.5)
Experimento Hershey y
Chase
 Hershey y Chase
demostraron que el ADN y
no las proteínas eran
Fago T2 no responsables de dirigir la
marcado reproducción del Fago T2
durante su infección en
Adición del fago E. coli en E.coli
medio radioactivo 32P y 35S

35
S
32
P

Los fagos de la
progenie quedan
marcados

Fagos marcados infectan a

bacterias no marcadas

cubiertas
cubiertas
Bacterias marcadas con marcadas con Bacterias no marcadas
no 35
P 35
S
marcadas

Se producen fagos viables Se producen fagos viables no

marcados con 32P marcados
Enzimas de restricción
(endonucleasas)
Se une específicamente a DNA de doble cadena y lo
escinde en sitios específicos dentro o adyacentes a
una secuencia en particular conocida como
secuencia de reconocimiento
900 enzimas de restricción aisladas a partir de 230
especies de bacterias

Nomenclatura:
Basada en la bacteria de la cual fue aislada
E Escherichia Primera letra del género
co coli Dos primeras letras de la especie
R RY13 Primera letra de la cepa
I Orden en que fue identificada en la
bacteria (número romano)
Nombre enzima de restricción: EcoRI
Metiltransferasa: transferencia de grupo metilo a
citosina o adenina de la molécula de
DNA
Enzima de restricción: escinde el DNA no metilado
EcoRI

EcoRI metilasa

No corte
Clasificación de las enzimas de restricción

Tipo I: posee actividad de restricción y metilación. Se

une a la secuencia de reconocimiento y corta en sitios
aleatorios

Tipo II: sistema binario en donde una enzima de

restricción corta una secuencia específica de
nucleótidos y una metilasa modifica la misma secuencia
(reconoce secuencias palíndromes)

Tipo III: posee actividad de restricción y metilación.

Corta el DNA en la secuencia de reconocimiento
Extremos que generan las enzimas de restricción

Extremos cohesivos

Extremos romos

Extremos cohesivos
Electroforesis ADN

Electroforesis: técnica para la

separación de moléculas (ácidos
nucleicos) según la movilidad de estas
en un campo eléctrico a través de una
matriz porosa, la cual finalmente las
separa por tamaños moleculares y
carga eléctrica
Grupo P (carga Electrodo positivo
negativa) (ánodo)
 La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas),
que tiene la propiedad de permanecer líquido por encima de aprox.
50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. Este gel está
constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
polimericas, que retarda el paso de las moléculas de ácido nucleico.

Al preparar el gel enfriando la agarosa en un molde adecuado, se

dejan en él unos huecos o pocillos para poder introducir luego en
ellos la muestra.

http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/gel_electrophoresis.

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.htm
Paso del DNA a través del poro formado en la
matriz
Efecto de la topología
Visualización de ADN en gel de agarosa

Fluorece bajo luz

Tinción con bromuro de etidio
UV
Para un ácido nucleico, la carga eléctrica es proporcional a la
longitud en nucleótidos. El efecto de retardo debido al gel depende
del tamaño molecular. La electroforesis separa los fragmentos de
ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en o en pares
de bases. Es posible establecer una curva de calibrado que
relacione la movilidad con la longitud en pb. Para conseguir una recta
se suele representar tamaño frente a 1/movilidad (como en la figura)
o log(tamaño) frente a movilidad.
Electroforesis de campos
pulsados
Southern blot

El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de

secuencias específicas de DNA, mediante el uso de electroforesis en
gel y de hibridación utilizando sondas especificas.
Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser
previamente fragmentada, por ejemplo utilizando enzimas de restricción.
El nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido
Southern del investigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot
que significa traspasar.
1. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño
mediante una electroforesis en gel de agarosa.
2. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos
de DNA se traspasan a un filtro de nitrocelulosa ó a una membrana
de nylon.
3. El filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la
secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de
ácido nucleico, DNA o RNAm que reconocerá a la secuencia de DNA
inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias
complementarias de ácidos nucleicos.
Transferencia por
capilaridad
Membranas para transferencia de ácidos nucleicos

Propiedad Nitrocelulosa Nylon Nylon

neutro cargado
Capacidad (μg ácido 80-120 ~100 400-500
nucleico/cm2)

Tamaño del ácido >400 pb >50 pb >50 pb

nucleico para máxima
unión
Buffer de transferencia Alta fuerza Baja fuerza iónica a amplio
iónica a pH rango de pH
neutro
Inmobilización Hornear 80°C Hornear 70°C/1 h o
con vacío/2 h radiación UV (254 nm)
Factores que afectan la estabilidad de los híbridos

Temperatura
> temperatura → > astringencia
Fuerza iónica
> fuerza iónica → < astringencia
iones Na+
Pasos para el análisis Southern blot

• Extracción del DNA genómico

• Digestión del DNA genómico
• Separación del DNA en gel de agarosa
• Desnaturalización del DNA (NaOH)
• Neutralización del DNA (NaCH3COOH)
• Transferencia a membrana
• Hibridación
• Lavados
• Revelado