CITOMETRIA DE FLUJO: NUEVAS APLICACIONES

DR. PEDRO ARAUCO NAVA

MDULA SEA NORMAL

Eosinfilos

Neutrfilos Monocitos CD34+ HPC Rojos nucleados Linfocitos

DISTRIBUCIN DE POBLACIONES EN MDULA SEA NORMAL

SUBPOBLACIONES MO % CD34+ % CD34+ y/o CD117+ % Eritroide % Neutrfilos % Monocitos % Eosinfilos % Basfilos % Mastocitos % Plasmticas % Linfocitos B maduros % Linfocitos B precursores % Linfocitos T % Linfocitos NK % NORMAL MO 1.1 0.6 (0.3-2.6) 2.2 1.4 (0.6-6) 4.7 2.1 (2-9) 67 6.1 (57-80) 4.3 1.4 (2-6.5) 2.5 1.3 (0.8-5) 0.4 0.7 (<0.1-2.4) 0.02 0.01 (<0.03) 0.2 0.2 (0.01-0.5) 2.9 1.5 (1.6-6.3) 0.9 1.5 (0.1-3.9) 9.2 4.5 (2.6-18) 2.8 1.4 (0.7-5)

ANTGENOS Y LINAJES

CAMBIOS FENOTPICOS DE DIFERENCIACIN NEUTROFLICA NORMAL

MYELOBLASTO PROMIELOCITO MIELOCITO
METAMIELOCITO

SEGMENTADO

CD15 CD64 CD13 MPO CD65 CD35 CD11b

102

CD13
103

CD33

CD16
101

CD10

CD34 HLA-DR CD117 CD54

CAMBIOS INMUNOFENOTIPICOS DURANTE LA MADURACION NORMAL DE NEUTROFILOS

MIELOBLASTOS PROMIELOCITOS MIELOCITOS
METAMIELOCITOS CAYADOS / SEGMENTADOS

CD13
103

CD11b
102

CD16
101

DIFERENCIACIN MONOCTICA EN MO NORMAL

CD64-PE

CD14-PE CD36-FITC IREM-2 FITC

HLADR

CD64

CD36

CD14

IREM2

CAMBIOS FENOTPICOS DE MADURACIN NORMAL DE CLULAS DENDRTICAS PLASMACITOIDES EN MO

ESTADO I ESTADO II ESTADO III ESTADO IV

CD 123 PE
103

CD 36 FITC HLA DR PERCP CD 117 APC

102

BDCA4 PE BDCA2 PE CD 34 APC

CD 33 APC

101

CAMBIOS FENOTPICOS DURANTE LA DIFERENCIACIN NORMAL DE MASTOCITOS

CD117 cytG4 (Triptasa) CD203c cytB12 (Tryptase)

HLA-DR

cytG3 (Triptasa) FceRI

CD34

CAMBIOS FENOTPICOS DURANTE DIFERENCIACIN DE BASFILOS

CD123

CD203

CD34
HLA-DR CD117

2D7

FceRI

Secuencia de maduracin de los linfocitos B en la MO normal : Los progenitores B ms inmaduros seran CD19, coexpresando CD34, TdT y CD22, y corresponden aproximadamente al 0,15 y 0,07 % del total en la celularidad medular en nios y adultos, respectivamente

Posteriormente, el precursor B incrementara la expresin de TdT y coexpresara CD10 y CD19, probablemente en esta secuencia. Dentro de las clulas precursoras B que ya expresan el antgeno CD19 en la MO normal, pueden diferenciarse claramente tres estadios madurativos mayoritarios cuyas proporciones y nmeros absolutos varan con la edad . La subpoblacin CD19 + ms inmadura (CD19dbil , CD34 + , TdT + , CD10intenso , CD22dbil , CD45dbil , CD38intenso , CD20-) supone aproximadamente el 0,7 % del total de las clulas nucleadas de MO normal en el nio y el 0,15 % en el adulto

La subpoblacin CD19 + en un estadio intermedio de diferenciacin (CD19 + , CD34-, TdT-, CD10 + , CD22dbil , CD45 + , CD38intenso , CD20dbil ) supone aproximadamente el 6,5 % del total de clulas nucleadas de la MO normal en el nio y el 0,8 % en el adulto. Algunos autores sugieren la existencia de pequeas subpoblaciones con fenotipo de transicin entre estas dos subpoblaciones (CD10intenso , CD20-, TdT-, CD34-)

La subpoblacin CD19 + ms madura (CD19 + , CD34-, TdT-, CD10-, CD22intenso , CD45intenso , CD38dbil , CD20intenso ) supone aproximadamente el 2,5 % del total de clulas nucleadas de la MO normal tanto en el nio como en el adulto . Por tanto, la MO del nio es muy rica en clulas B inmaduras mientras que en el adulto predominan habitualmente los linfocitos B maduros

As, las clulas B inmaduras o en estadio intermedio de diferenciacin suponen aproximadamente el 70 % de todas las clulas B de la MO normal en individuos menores de 15 aos, mientras que en el adulto la poblacin que predomina es la ms madura (70 % del total de clulas B). La transicin entre estos dos patrones fenotpicos, de nio a adulto, ocurre aproximadamente a la edad de 15 aos, debido fundamentalmente a la reduccin de las dos poblaciones de clulas CD19 + ms inmaduras

Fenotipos aberrantes
Intensidad fluorescente anormal por Ac Ausencia o sobreexpresin de Ac Expresin asincrnica madurativa Maduracin/compartimento biolgico Curva de maduracin anormal Expresin antignica de varios linajes

Inmunofenotipos leucmicos

Kern W. Et al. Critical Rew in Oncol 2005

Introduccin. ERM en LMA adultos. Puntos de corte

*

*LAIP: fenotipo leucmico aberrante

San Miguel JF et al. Blood 2001

EMR despus del tratamiento de Induccin

Inmunofenotipos Leucmicos (1)

LAIPs
LLA-T (n=4)
3 IL/ paciente
NUM

LLA-B (n=43)
Entre 1 y 5 IL/ paciente
Cross-Lineage CD19+CD33+ CD19+CD13+ CD19+CD15+ total Asincronismos CD19+CD22++CD34+ CD19+CD22++CD20CD20+TdT+ IgMc+TdT+ total Hiperexpresin CD34+++ CD10+++ total Fenotipos infrecuentes CD19+CD45CD19+CD34+CD10CD19+CD34-CD10++ CD19+CD20-CD10Total

NUM
13 7 3 23 5 5 1 2 13 4 16 20 22 9 6 5 42

FSC/ SSC Hight FSC/ SSC total Asincronismos TdT+CD5+ total Fenotipos ectpicos CD1a+ CD3-CD4+CD8+ CD3dimCD7+ CD3dim/-CD4-CD8total Fenotipos infrecuentes CD34+CD7+ Total Prdidas antignicas CD5Total

1 1 1 1 2 2 1 2 7 1 1 1 1

(1)

No incluidos KOR-SA ni NG2

Introduccin. ERM en LLA nios. Puntos de corte

Coustan-Smith E et al. Blood 2000

EMR POST-TRATAMIENTO DE INDUCCIN

Leukemia August 2001, Volume 15, Number 8, Pages 1185-1192

BIOMED-1 concerted action report: flow cytometric immunophenotyping of precursor B-ALL with standardized triple-stainings

Aplicabilidad ERM por CMF

Laips N pacientes 4 8 10 4

23/27: 87.5%
LAIP 2 Combinaciones 4 fluorocromos

1 2 3 4

FRECUENCIA DE FENOTIPOS ABERRANTES POR CITOMETRIA DE FLUJO

LA Bifenotpica

LLA-T
LLA-B DLPC-B Gammapata monoclonal LMA DLPC-T SMD/SMP

% 100 99 95 95 90 75 NA NA

Introduccin. Aplicabilidad CMF

LLA
LMA

virtualmente 100%
3 colores 4 colores 60% 80% aprox

ERM. Aplicabilidad en LLA-B. PCR

Alteracin gentica tipo de muestra Aplicabilidad t(9;22)(q34;q11) (BCR-ABL) RNA Adulto Nios 30-35% 5-8%

t(4;11)(q21;q23) (MLL-AF4) m-RNA

Adulto Nios

3-6% 3%

Infant
t(1;19)(q23;p13) (E2A-PBX1) m-RNA Adulto Nios

>75%
<5% 5-8%

t(12;21)(p13;q22) (TEL-AML1)

m-RNA

Adulto
Nios

<1%
30%

30-35% Nios 40-45%Adultos

ERM. Aplicabilidad en LLA-T. PCR

Alteracin Tipo de muestra Aplicabilidad

TAL1 del (SIL-TAL1)

DNA

10-25% 3-5% 1-3% 1-3%

t(11;14)(p13;q11) (RHOM1-TCRd) DNA t(1;14)(p32;q11) (TAL1-TCRd) t(10;14)(q24;q11) (HOX11-TCRd) DNA DNA

Total:

10-25%

ERM. Aplicabilidad en LMA. PCR

Alteracin PML-RAR AML1-ETO CBF-MYH11 tipo muestra Aplicabilidad

m-RNA m-RNA m-RNA Total:

7-8% 7-8% 7-8% 21-24%

MLL-PTD

RNA/DNA

5-11%

FLT3-ITD

RNA/DNA
Total:

28-33%
33-44%

VALOR PREDICTIVO DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN LA DETECION DE ANOMALIAS CITOGENETICAS

Solo blastos

La ms frecuente de las translocaciones (25% de los casos). Buen pronstico.

30% en adultos y 5% nios Mal pronstico

CD19PeCY5

Inmunofenotipo de LLA-B con fenotipo BCR/ABL

Normal BM CD34+ B-cells

100 10 1 102 10 3 104 100 10 1 10 2 103 104 CD10 -> AP36452.003 CD13 PE -> UVJ39869.004 100 10 1 102 CD34 PE -> UVJ39869.002 103 10 4 100 10 1 102 103 104 CD34 -> MO21489004

DNA diploid Bcr/abl+ ALL

100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 10 2 103 104

CD10 -> HG30672.002

CD13 -> HG30672.010

CD34 -> HG30672.008

CD34 -> HG30672.006

DNA aneuploid Bcr/abl+ ALL

100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 102 103 10 4 100 10 1 10 2 103 104

CD10 -> RFR7690.008

CD13 -> RFR7690.008

CD34 -> RFR7690.007

CD34 -> RFR7690.011

AL: GENOTYPIC-PHENOTYPIC ASSOCIATIONS

Diagnosis B-ALL Genetic t(9;22)* t(12;21) 11q23/t(4;11) Aberrant immunophenotype CD34hi,CD10+,CD38lo,CD13lo CD34het,CD10+,CD20-,CD13lo CD34+,CD10-,7.1+,CD15+

AML

t(15;17)
Inv(16) t(8;21) 11q23

CD34-/+,CD15-/lo,CD2-/lo,CD13het
MPOhi,CD2-/lo CD19+,CD56+ CD56+,7.1-/+,CD19-/lo,CD2-/+

GENTICA Y LEUCEMIAS

AML-M2 con t(8;21) AML1/ETO: 2/3 de novo CD19+ , y usualmente CD34+. Favorable. AML-M2 con t(8;21) : 1/2 de novo expresan CD56, periodo corto de remision y disminucion de sobrevida. [Arber,D. AJCP Ene2002;117(3)] AML-M3 con t(15;17) PML/RAR: HLA-DR-, CD15-. Favorable. AML-M3 con CD56+: recada temprana y/o resistencia a ATRA.

CD61,CD41,HLA-DR con MPO-, CD13-, CD33-, CD117-, CD34,CD15, CD14AML-M7 con t(1;22) OTT/MAL:
Hrusak, O y Porwit-MacDonald. Leukemia 2002, Sep16, 1233-1258

DETECCIN RPIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS EN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFTICOS

Transformed SSC

CD3 - APC CD56 / sIg kappa - PE CD4 / CD19 - PCy5

CD4 / CD19 PCy5 CD8 / sIg lambda - FITC CD8 / sIg lambda - FITC

CD3 - APC

DETECCIN RPIDA DE NEOPLASIAS MALIGNAS EN ASPIRADOS DE GANGLIOS LINFTICOS

CD56 / sIg kappa - PE CD4 / CD19 - PCy5 CD8 / sIg lambda - FITC CD4 / CD19 - PCy5

CD3 - APC

NORMAL

CD3 - APC

B-DLPC

CD56 / sIg kappa - PE

CD8 / sIg lambda - FITC

Los resultados de inmunohistoqumica y citometra de flujo no son comparables

Citometra: antgeno nativo (no modificado): mas sensible / menos especfica (Alto VPN) Inmunohistoquimica: Antgeno modificado (Alto VPP)

EL PORCENTAJE ESTIMADO DE

INFILTRACION MEDULAR SIEMPRE ES

MAYOR EN LA BIOPSIA QUE EN LA

CITOMETRIA DE FLUJO Y NO GUARDAN

UNA RELACION CONSTANTE

Sindromes linfoproliferativos
COMPARACION DEL % DE INFILTRACION MEDULAR POR MORFOLOGIA Y CITOMETRIA DE FLUJO
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52

n = 200

PORCENTAJE

55

58

CASOS MORFOLOGIA CITOMETRIA

61

N = 200

BIOPSIA: FALSOS NEGATIVOS: 9%

CITOMETRIA DE FLUJO: FALSOS NEGATIVOS: 5,5%

La deteccin de neoplasias linfoides mediante citometra de flujo puede tener limitaciones

Linfomas de clulas grandes Linfomas anaplsicos Enfermedad de hodgkin

anticuerpos para el complejo GPIIb/IIIa, tales como 7E3, LJ-CP3 y LJ-P9, AP-3, en los que se ha demostrado un aumento de su unin despus de la activacin de la plaqueta GPIIb/IIIa y GPIV, expresin aumentada tras la activacin de la plaqueta, la unin a la superficie de la plaqueta de anticuerpos monoclonales para diferentes eptopos del complejo GPIb/IX/V disminuye.

Estudios realizados en sangre entera demuestran que la trombina induce una disminucin acentuada de la unin de los anticuerpos monoclonales 6D1, especfico para el factor de Von Willebrand ( vWF) ligado a GPIb; FMC25, especfico para GPIX y AK1 especfico para el complejo. Otros agonistas, tales como el ADP, adrenalina y colgeno ejercen un efecto similar sobre la expresin de GPIb/IX/V, pero en menor grado

Estados conformacionales de GPIIb/IIIa y de sus ligandos: El anticuerpo PAC-1 se dirige al lugar de unin del fibringeno en el complejo GPIIb/IIIa Despus de la activacin del complejo GPIIb/IIIa, ste se une a molculas de adhesin (fibringeno, vWF, vitronectina y fibronectina) y esta unin puede ser monitorizada con anticuerpos especficos para cada uno de los ligandos

Inmunofenotipaje de trombastenias La citometra de flujo puede ser usada junto con anticuerpos monoclonales para cuantificar el nmero de complejos GPIIb/IIIa y GPIb/IX/V y as, evaluar la homozigosia o heterozigosia en la enfermedad de Bernard Soulier y en la Trombastenia de Glanzmann

CD4+ y CD8+ T evaluacin funcional, mediante su capacidad para inducir moleculas de superficie (CD154,CD69) o de factores solubles (IL-2,TNF-a,IFN-y) implicados en la colaboracion con las celulas B, lo que puede estar directamente afectando a la capacidad de produccion de inmunoglobulinas por parte de estas ultimas.

MORFOLOGA Y CITOQUMICA

CITOGENTICA

DIAGNSTICO

CITOMETRA DE FLUJO

CLNICA

BIOLOGA MOLECULAR