BIORREACTORES Y PROCESO DE FERMENTACION

Caldos de Fermentacin
Los caldos de fermentacin son la combinacin de biomasa insoluble (Bacterias, hongos, clulas animales o vegetales), fluido nutritivo (Fuente de carbono, nitrgeno, minerales, vitaminas, inductores) y metabolitos solubles resultado de las operaciones de fermentacin (etanol, acido ctrico, penicilina) .

Componentes de los medios de cultivo

Un medio de cultivo debe contener los requerimientos necesarios para que las clulas crezcan adecuadamente.
Peptonas: Fuente de protena.

Fuente de carbono

Fuente de nitrgeno.

Clula

Sustancias inductoras.

Trazas de vitaminas y aminocidos esenciales

Fuentes de carbono
Las fuentes de carbono suministran principalmente energa para que la clula pueda realizar sus procesos metablicos. Las fuentes de carbono utilizadas en fermentaciones deben ser fciles de asimilar, muy energticos y de bajo costo. De entre los ms utilizados en procesos fermentativos est: Glucosa, sacarosa, hidrolizados de jarabe de maz, melazas (Subproducto de la caa de azcar; fuente de sacarosa; posee 50-60% carbohidratos; 2% compuestos nitrogenados.), extractos de Malta (90% carbohidratos base seca), aceites (poseen algunas propiedades anti-espumantes), suero lctico (1.25% lactosa, 0.25% protenas), hidrocarburos (alcanos C10 - C12, metabolizados por algunos microorganismos), celulosa (pre-tratamientos para su asimilacin)

Fuente de nitrgeno
El nitrgeno es muy importante para la sntesis de protenas y cidos nucleicos y otros compuestos nitrogenados. Los sustratos nitrogenados mas utilizados son: extractos de Soya: (50% protena y algunos minerales), licor de maz, extractos de levadura (aportan muchos factores de crecimiento), nitrgeno orgnico (derivados de productos de carne y pescado).

Peptonas
Las peptonas son pptidos obtenidos de la hidrlisis parcial de protenas como de extractos de carne y leche y son la fuente ms importante de aminocidos para las clulas.

Pptidos

Sustancias inductoras
Estas sustancias inducen la alta expresin de genes necesaria para la sntesis de metabolitos especficos, dentro de los inductores ms utilizados est el isopropiltiogalactsido (IPTG), las hormonas por ejemplo en cultivo de tejidos vegetales las auxinas y citoquinas. La caracterstica principal de estas sustancias es que no deben ser txicas, pero si estables y solubles en el medio.

Anti-espumantes
Durante el metabolismo se genera gases, principalmente CO2 y fcilmente se puede acumular en forma de espuma. La formacin de espuma se relaciona directamente con las protenas presentes en el medio. Para evitar este problema en los procesos fermentativos se incluye en el medio antiespumantes, los cuales deben cumplir con algunas caractersticas como generar dispersin rpida, ser altamente activos a bajas concentraciones, de accin prolongada, no txicos, de bajo costo y muy estables en el medio de reaccin. Los ms empleados son: alcohol estearlico, cidos grasos, derivados Glicricos, octildodecanol, siliconas, sulfonatos y polipropilenglicol.

Antiespumante

Rompimiento de fuerzas de cohesin entre molculas.

Asepsia
Dentro de todo proceso biotecnolgico la asepsia es una etapas de gran importancia. Todo componente utilizado durante el proceso debe estar libre de agentes contaminantes como: bacterias, levaduras, esporas de hongos etc. Esta asepsia involucra la limpieza y esterilidad del: material, los medios, recipientes de cultivo, cuartos de cultivo, lugares de transferencia, operarios, herramientas con los cuales se lleva a cabo la manipulacin de los cultivos.

Asepsia para un proceso fermentativo

Cuando las fermentaciones tienen una capacidad de aproximadamente 10 litros o menos, el proceso de esterilizacin se realiza mediante la introduccin del equipo y el medio de cultivo en autoclaves. Cuando la capacidad de fermentacin supera los 100 litros hasta 10.000 L. Las materias primas son esterilizadas dentro del fermentador, mediante la introduccin directa de vapor al interior del recipiente. Cuando las fermentaciones se realizan a gran escala (mayor a 40.000L), cada pieza de los equipos es esterilizada mediante vapor y enfriada con aire estril, mientras el medio de cultivo es esterilizado por medio de intercambiadores de calor.

Autoclave

Intercambiador de calor

Inoculacin de microorganismos
Para fermentaciones a pequea escala, el inoculo se prepara de forma previa en pequeos recipientes. De forma estndar se a determinado que el volumen del inoculo debe ser aproximado al 10% del volumen final de la fermentacin Para fermentaciones a gran escala se procede a tener uno o mas reactores interconectados en los cuales se realiza el crecimiento de la biomasa, hasta alcanzar un volumen lo suficientemente grande para inocular el reactor principal

Fermentadores
Las funciones de los fermentadores son: mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen de cultivo a fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin, mantener constante y homognea la temperatura, minimizar los gradientes de concentracin de nutrientes, suministrar oxgeno a una velocidad tal que satisfaga el consumo. Existen diversos tipos de fermentadores, dependiendo del tipo de fermentacin a realizar y el tipo de clulas con las que se trabajen. Los reactores de tanque agitado son comunes para trabajar con clulas microbianas y vegetales. Fermentador de tanque agitado

Fermentadores
Los fermentadores son diseados dependiendo del tipo de clula que se va a emplear en la fermentacin. Por ejemplo los reactores para clulas animales contienen soportes internos de colgeno, el reactor para algas es un fotobiorreactor que est diseado para el crecimiento de estos microorganismos.

Reactor para clulas animales

Fotobiorreactores para el crecimiento de algas

Separacin y purificacin de productos de fermentacin

La primera etapa en un proceso de obtencin de productos de fermentacin, es la separacin de los elementos slidos insolubles (biomasa) y los elementos solubles en el medio (Sustrato y metabolitos). Lo anterior se realiza mediante tcnicas de centrifugacin filtracin y evaporacin

Esquema Centrifuga de discos para la separacin de biomasa

Filtro de membrana

Esquema de proceso de evaporacin

Metabolitos obtenidos de un proceso fermentativo

Metabolitos Primarios (producto intracelular)

Metabolitos Secundarios (producto intracelular o extracelular)

Rompimiento celular Mecnico Qumico Osmtica

Rompimiento celular solo si hay metabolito intracelular

Mtodos de separacin

Absorcin

Afinidad

Intercambio inico

Separacin por intercambio inico

Mecanismo mediante el cual se separa una partcula por su carga.

Mecanismo de separacin por absorcin

Mecanismo mediante el cual una partcula es absorbida por un agente absorbente: Carbn Activado Geles de slica Alminas

Mecanismo de separacin por afinidad

Mecanismo mediante el cual una molcula es separada por un agente especficamente selectivo como un anticuerpo.

Estequiometria de reactores
Dentro de los procesos fermentativos la cuantificacin de las variables mas importantes relacionadas con el proceso deben ser determinadas para poder evaluar que la fermentacin se este realizando de forma apropiada o para dar por terminado el proceso fermentativo o si hay que realizar algn ajuste al proceso. Estas variables son principalmente: Biomasa (X); Sustrato (S) y Producto (P)
La ecuacin general de velocidad de acumulacin de Ci (X, S y P) dependen del sistema utilizado (Batch, fedbach, continuo).

Balance en un sistema discontinua (Batch)

En batch no hay entrada ni salida de componentes i (S, X y P) en el biorreactor, por tanto la velocidad de ingreso y de salida son cero. La velocidad de acumulacin de los componentes Ci en este caso depende de la velocidad de formacin y consumo de los mismos. En estos sistemas fermentativos el volumen se mantiene constante. La ecuacin de velocidad de acumulacin del componente i es:

V = constante

V = volumen de cultivo F1= caudal de alimentacin, F2 = caudal de salida, Ci1 = concentracin del componente "i" en la alimentacin Ci = concentracin en el caudal de salida. rfi y rci = velocidad de formacin y consumo del componente "i" respectivamente.

Balance de biomasa en un sistema discontinuo (Batch)

Es el balance de la concentracin de clulas dentro del medio de cultivo en discontinuo. Para calcular este balance se considera una curva de crecimiento microbiano tpica, donde se presentan las siguientes etapas: Latencia, exponencial, estacionaria y muerte. En este caso se considera una cintica de crecimiento de Monod, donde la velocidad de crecimiento es (nmero de clulas que se dividen con respecto al tiempo). La fermentacin termina cuando el sustrato se acaba. Se puede dar inhibicin por acumulacin de producto.
tiempo de duplicacin (h) 0,5-1,15 1,15-3,0 17-70 23-100

Cultivo bacterias levaduras y hongos filamentosos clulas animales clulas vegetales

(h-1)

=ln2/T

0,6-1,4 0,2-0,6 0,01-0,04 0,007-0,03

Balance de biomasa en un sistema discontinuo (Batch)

El balance de biomasa puede ser calculado considerando que no hay muerte celular Kd=0. De esta manera se obtiene la ecuacin ms simple para determinar biomasa en un tiempo determinado

Densidad () constante No hay flujo de entrada ni de salida Cintica tipo Monod Kd=Constante de muerte celular Donde Xo es la cantidad de biomasa inicial

Balance en un sistema discontinuo (Fedbach)

En la fermentacin fedbach, el caudal de salida de medio es cero pero el volumen no es constante (aumento de volumen con el tiempo), esto indica que la velocidad de acumulacin depende de la velocidad de ingreso de los componentes y de la velocidad de formacin y consumo de estos. El sustrato trata de mantenerse constante, la biomasa aumenta y el producto aumenta conforme aumenta el volumen.

Balance en un sistema discontinuo (Fedbach)

Ya el proceso de fermentacin finaliza cuando el volumen del recipiente no puede contener ms medio de cultivo. Puede darse en algunos casos inhibicin por acumulacin de sustrato y de producto. La ecuacin para calcular la velocidad de acumulacin es:

V = volumen de cultivo F1= caudal de alimentacin, F2 = caudal de salida, Ci1 = concentracin del componente "i" en la alimentacin Ci = concentracin en el caudal de salida. rfi y rci = velocidad de formacin y consumo del componente "i" respectivamente.

Balance en un sistema continuo.

En este tipo de fermentacin, la velocidad de entrada y de salida es la misma, la concentracin de todos los componentes se mantiene constante. La fermentacin termina cuando el operario decide finalizar el proceso. Las clulas se mantiene en constante crecimiento.

Balance en un sistema continuo.

Un sistema en continuo trata de evitar la acumulacin por producto o por sustrato ya que tanto la concentracin de sustrato como de producto tratan de mantenerse constante. La biomasa aunque esta en constante crecimiento, no hay una fase de muerte por que salen por el flujo de salida conforme salen los componentes por el caudal de salida. En las siguientes diapositivas se muestra el balance de cada uno de los componentes.

V = volumen de cultivo F1= caudal de alimentacin, F2 = caudal de salida, Ci1 = concentracin del componente "i" en la alimentacin Ci = concentracin en el caudal de salida. rfi y rci = velocidad de formacin y consumo del componente "i" respectivamente. Ambos caudales son iguales V es constante

Balance de sustrato en un sistema continuo

La velocidad de acumulacin de sustrato depende del sustrato de entrada, del sustrato de salida y del sustrato consumido por las clulas. La concentracin de sustrato de salida debe ser mucho menor que la concentracin de sustrato de entrada, para que el proceso sea eficiente (solo se elimina un 10% del sustrato entrante). Se puede calcular el rendimiento de producto y biomasa con respecto al sustrato. La constante de formacin de producto (qp) es la velocidad a la cual la clula forma producto.

Densidad () constante

Cintica tipo Monod

El flujo de entrada es igual que el de salida YX/S=rendimiento de biomasa con respecto a sustrato YP/S=rendimiento de producto con respecto a sustrato

m=coeficiente de mantenimiento
qp=constante de formacin de producto

Balance de producto en un sistema continuo

La velocidad de acumulacin de producto depende de la formacin de producto, de la degradacin de producto por inestabilidad de este. La formacin del producto puede estar asociada directamente al metabolismo en los metabolitos primarios (Depende del crecimiento celular, fase exponencial). Para metabolitos secundarios, la velocidad de acumulacin de producto no es dependiente del metabolismo primario.

Cintica tipo Monod D=F/V=taza de dilucin qp=velocidad de formacin de producto kp=velocidad de degradacin de producto Considerando que el producto puede ser metabolito primario (asociado al metabolismo) o metabolito secundario (no asociado al metabolismo directo) se tiene la siguiente relacin donde

Balance de biomasa en un sistema continuo

La velocidad de acumulacin de biomasa en continuo depende de la biomasa de salida, el crecimiento () y muerte celular. No hay entrada de biomasa. La taza de dilucin es la velocidad a la cual entra liquido y diluye la concentracin de los componentes. La Kd es un valor que indica la cantidad de clulas que mueren en un tiempo determinado (h-1). La densidad del medio es constante viene dada en gramo por litro.

Densidad () constante Flujo de entrada libre de clulas Cintica tipo Monod Kd=Constante de muerte celular Fe/V = taza de dilucin.