PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR Polymerase Chain Reaction) es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo consiste en obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular. En teora basta partir de una nica copia del ADN original (tambin llamado molde o templado). Su utilidad se basa en que luego de la amplificacin resulta mucho ms fcil estudiar un determinado fragmento de ADN.

Estos usos derivados de la amplificacin llevaron a que se transforme en una tcnica ampliamente utilizada. La PCR es una tcnica comn y en muchos casos indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica debido a su gran variedad de aplicaciones biomdicas. La tcnica de PCR se basa en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se utilizan ciclos (repeticiones) con altas y bajas temperaturas alternadamente.

Descripcin General

Para hacer copias de un gen hay que conocer las regiones que lo delimitan y contar con su secuencia. Los oligonucletidos de iniciacin determinan los lmites de la regin amplificada. Normalmente, la reaccin se lleva a cabo con una DNA polimerasa de Thermus aquaticus, una bacteria termoflica. Por ello, la enzima es capaz de soportar las altas temperaturas de la reaccin. El nombre del enzima es Taq. La velocidad de sntesis de las nuevas cadenas es de 1Kb por minuto aproximadamente. La sntesis es seguida de una etapa de desnaturalizacin, de 1 minuto a 93C, y anillamiento de los primers durante otro minuto, de acuerdo a su Tm. Al finalizar la reaccin (20-35 ciclos) se observa un enriquecimiento de los fragmentos copiados entre los dos primers. El anlisis de fragmentos se hace por electroforesis en gel de agarosa, y ticin del DNA con bromuro de etidio.

Diseo de oligonucletidos iniciadores primers

Los primers tienen que ser complementarios a la secuencia a amplificar. Deben de hibridarse exactamente. Si no, no hay amplificacin, o tiene lugar una aamplificacin inespecfica. La longitud del primer determina la especificidad. Un primer de 8 nucletidos se anillar en 1/65536pb. En el genoma humano, hay 3000000 pb, luego puede anillarse en 46000 sitios distintos. Un primer de 18 nucletidos se unir en 1/17179869184pb. O sea, en un solo sitio. Los primers no pueden ser todo lo largos que se quiera, porque esto afecta a la velocidad de hibridacin y la eficiencia del proceso. En consecuencia, los primers nunca exceden 30 nucletidos.

Pasos a seguir:
Inicializacin: este paso se realiza para desnaturalizar el ADN, y consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-95C, que se mantiene durante 5-9 minutos. 2. Desnaturalizacin: en primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de GC que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma. 3. Annealing / Alineamiento / Unin del primer: a continuacin se producir la hibridacin del primer, es decir, el primer se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65C permitiendo as el alineamiento. La temperatura ptima de annealing es especfica para cada primer; y depende de los puentes de hidrgeno que se forman entre las cadenas de ADN (unin ADN primer-ADN molde). Temperaturas altas de annealing impedirn la unin del primer al ADN molde; y temperaturas bajas llevarn a una unin inespecfica.
1.

4.

5. 6.

Extensin / Elongacin de la cadena: acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del primer como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTPs complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-P de los dNTPs con el grupo 3'-HO del final de la hebra de ADN creciente. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad est, comnmente, en 72 C. El tiempo de extensin depende tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. La Taq polimerasa, en su temperatura ptima, polimerizar 1000 bases/minuto. Los pasos 2,3,4 se repiten unas 25-35 veces Elongacin Final: etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 72C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.

En 1983 Kary Mullis da a conocer esta tcnica y en 1993 recibi el Premio Nobel de Qumica por este descubrimiento

Es un proceso cclico (cada ciclo consta de 3 pasos)

94C desnaturalizacin (separacin de las dos hebras de ADN) 50C Anillamiento de "cebadores"

72C copia de cada una de las hebras de ADN por la ADN polimerasa

35 ciclos

236= 68 billones de copias

Reactivos necesarios para PCR:

Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2. MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la funcin de la polimerasa dNTPs (Deoxinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. -La concentracin de dNTPS, es proporcional al tamao del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos ms concentracin de dNTPS para el de 5500pb. -Generalmente, se usa una concentracin de 200M de cada uno.

Reactivos necesarios para PCR:

Cebadores primers: Son secuencias cortas de nucletidos 20-24 nucletidos de longitud, complementarias a una regin del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentracin de 1MDNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucletidos de longitud. El mnimo va de 10-100 ng. y el mximo entre 400-500 ng. Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reaccin. (actualmente diferentes variantes de la Taq polimerasa)

Clculo de la temperatura
Cada

ciclo de PCR implica trs saltos de temperatura: La desnaturalizacin, a 94C La hibridacin de los primers, que depende de la longitud y composicin de los mismos. La extensin, que ocurre ptimamente a 74C para Taq.

Temperatura de Hibridacin
Es el factor mas determinante en la hibridacin. A temperaturas demasiado altas, no tiene lugar. Temperaturas demasiado bajas, tienden a favorecer hibridaciones inespecficas, alterando la especificidad de la reaccin. La temperatura ptima tiene que ser lo suficientemente baja para permitir la hibridacin especfica entre el primer y su secuencia complementaria, pero lo suficintemente alta, como para impedir hibridaciones no especficas. Esta temperatura puede calcularse en base a la temperatura de fusin (melting temperature) o Tm del hbrido.

Clculo de la Tm
La

se puede obtener experimentalmente, pero es mas habitualmente calculada en base a la siguiente ecuacin: Tm= (4x[G+C])+(2x[A+T])C Donde G,C,A y T es el nmero de nucletidos de cada tipo en el primer.

Tm

Temperatura de Hibridacin
La

temperatura de hibridacin estar, por tanto, 1-2C por debajo de la Tm (del primer con menor Tm) Es importante tener en cuenta que la PCR requiere el uso de dos primers, y que ambos deben de tener una temperatura de hibridacin semejante. De lo contrario, la reaccin no proceder normalmente !

VARIANTES DE PCR
RT-PCR : deteccin de mRNA PCR-RFLP: polimorfismo gentico RAPDs : amplificacin con random primers - polimorfismo

PCR Nested: amplificacin de una secuencia dentro de otra previamente amplificada

PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea

Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras

Long PCR : amplificacin de fragmentos grandes 10 -20 kb.

APLICACIONES DE PCR
INVESTIGACION BSICA
Diagnstico clnico Monitoreo y Evaluacin de terapia

Deteccin de cepas resistentes a antibiticos

Deteccin de mutaciones puntuales Polimorfismo gentico Filiacin humana Medicina Forense

Pedigr animal
Control de calidad