Identificacin de micobacterias

Dr. Armando Guevara P. Microbilogo Clnico

Gnero Mycobacterium
Gnero Mycobacterium: >100 especies

Complejo tuberculosis
Complejo lepra

Otras micobacterias

PARED CELULAR
LAM

Superficie
Lpidos superficiales

cido miclico Arabinogalactan

Peptidoglicano Membrana celular

Citoplasma
Fuente:. McMurray. 2000

DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
Baciloscopa
Cultivo
Fenotipia

Bioqumica

DIAGNSTICO MOLECULAR Tcnicas moleculares

IDENTIFICACIN FENOTPICA
Tincin de cido alcohol resistencia Temperatura de crecimiento Velocidad de crecimiento Morfologa de las colonias
Rpido Lento

Pigmentacin Fotorreactividad

Fotocromgenas Escotocromgenas No cromgenas

BACILOSCOPA
Coloraciones de Ziehl Neelsen y Kinyoun Fundamento: Unin de fucsina y complejos micolil - arabinogalactano

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN

BACILOSCOPA
No es diagnstica de M. tuberculosis Otros cido alcohol resistentes: Otras micobacterias Nocardia Legionella Rhodococcus Tsukamurella Cryptosporidium Isospora belli Cyclospora

Ausencia de BAAR no descarta enfermedad

10.000 bacilos por ml de esputo

BACILOSCOPA
Otra tcnica: Uso de colorantes fluorescentes Auramina Rodamina

CULTIVO
Requieren medios complejos Crecimiento depende de velocidad de crecimiento. M. tuberculosis: lento 3 a 6 semanas a 37C por tasa de duplicacin de 18 horas CO2 a 5-10% favorece crecimiento Medios: slidos selectivos lquidos no selectivos

CULTIVO
Descontaminacin
Homogeneizacin (fluidificacin o digestin)

Concentracin

AGENTES MAS USADOS PARA DESCONTAMINACIN

N-acetil-L-cistena mas 2% de NaOH Ditriteitol mas 2% de NaOH

Fosfato trisdico al 13% mas cloruro de benzalconio

NaOH al 4% Fosfato trisdico al 13% cido oxlico al 5% Cloruro de cetilpiridio al 1% ms 2% de NaOH

MEDIOS DE CULTIVO
Lowenstein Jensen Middlebrook 7H10 - 7H11 American Thoracic Society

Petragnani
Ogawa-Kudoh
Colonias de M. tuberculosis en medio Lowenstein Jensen

MEDIOS NO SELECTIVOS PARA AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS

Medio Lowenstein Jensen Ogawa-Kudoh Petragnani Medio de la American Thoracic Society Middlebrook 7H10 Middlebrook 7H11 Agente inhibidor Verde de malaquita al 0,025 gr/ml Verde de malaquita al 0,025 gr/ml Verde de malaquita al 0,052 gr/ml Verde de malaquita al 0,02 gr/ml Verde de malaquita al 0,0025 gr/ml Verde de malaquita al 0,0025 gr/ml

MEDIOS SELECTIVOS PARA AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS

MEDIO Modificacin de Gruft del Lowenstein Jensen AGENTES INHIBIDORES Verde de malaquita, 0,025gr/100ml Penicilina 50 U/ml, cido nalidixico, 35 mg/ml Verde de malaquita, 0,025gr/100ml Cicloeximida, 400 g/ml Lincomicina, 2 /ml cido nalidixico, 35 mg/ml Verde de malaquita, 0,0025gr/100ml Cicloeximida, 360 g/ml Lincomicina, 2 /ml cido nalidixico, 20 mg/ml Carbenicilina, 50 /ml Anfotericina B, 10 /ml Polimixina B, 200 U/ml Lactato de trimetoprima, 20 g/ml

Lowenstein Jensen modificado por Petran

Middlebrook 7H10 modificado por Petran

Selectivo 7H11 (Medio de Mitchison)

MTODOS BIOQUMICOS
Acumulacin de niacina Reduccin de nitratos Hidrlisis del Tween 80 Arilsulfatasa Catalasa Ureasa Pirazinamidasa Resistencia al T2H Crecimiento en MacConkey sin cristal violeta Crecimiento en NaCl al 5% Reduccin de telurito

MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS SEGN VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIN DE PIGMENTO

GRUPOS DE CRECIMIENTO LENTO Grupo I Grupo II Escotocromgenas Grupo III No cromgenas Fotocromgenas a)Pigmento rosa-rojo: M. Kansaii M. avium M. asiaticum M. lactis M. intracellulare b) Pigmento amarillo-naranja: M. gastri M. intermedium M. gordonae M. terrae M. scrofulaceum M. triviale M. flavescens M. nonchromogenicum M. szulgai M. malmoense c) Pigmento irregular M. haemophilum M. xenopi M. shimoide M. simiae M. celatum M. ulcerans M. interjectum M. branderi M. genavense

Continuacin
GRUPOS DE CRECIMIENTO RAPIDO Grupo IV Fotocromogena M. marinum Grupo V Escotocrmogenas Grupo VI No cromgenas a)Pigmento rosa-rojo: M. fallax M. engbaecki M. fortultum b)Pigmento amarillo-naranja: M. chelonae M. acapulcense M. abscessus M. aurum M. agri M. duvalii M. chitae M. gadium M. moriokaiense M. neoaurum M. confluentis M. gilvum M. mucogenicum M. obuense M. rhodesiae M. aichiense M. chubuense M. tokaiense c) Pigmento irregular M. phle M. vaccae M. thermoresistibile M. parafortuitum M. diernhoferi M. smegmatis M. austroafricanum

Fuente: Casal et al, 1999

PRUEBAS BIOQUMICAS SEGN GRUPO DE MICOBACTERIAS

No cromgenos Morfologa de las colonias en Lowestein Jensen Produccin de niacina Reduccin de nitratos Reduccin de telurito Catalasa semicuantitativa y a 68C Hidrlisis del Tween 80 Ureasa Tolerancia a NaCl al 5% Resistencia al T2H Pirazinamidasa Arilsulfatasa de 3 das
Fuente: Hernandez, 2000

Escotocromgenos Reduccin de nitratos Hidrlisis del Tween 80 Ureasa Tolerancia a NaCl al 5% Produccin de pigmento a 25C Arilsulfatasa a 42C Crecimiento a 52C

Fotocromgenos Reduccin de nitratos Hidrlisis del Tween 80 Catalasa semicuantitativa Ureasa Velocidad de crecimiento a 28C Produccin de niacina Arilsulfatasa de 3 das Produccin de pigmento: a. Oscuridad a 25C (-) b. Postfotoinduccin (+)

PRUEBAS BIOQUMICAS SEGN GRUPO DE MICOBACTERIAS

Pruebas para especies de crecimiento rpido (M. fortuitum-chelonei, M. smegmatis, M. phlei, M. vaccae) Arilsulfatasa de 3 das Reduccin de nitratos Incorporacin de hierro Hidrlisis del Tween 80 Tolerancia a NaCl al 5% Utilizacin del citrato de sodio, inositol, manitol Crecimiento en MacConkey sin cristal violeta Pruebas para identificacin Pruebas para identificacin del complejo M. aviumdel complejo M. tuberculosis intracellulare Produccin de niacina Reduccin de nitratos Catalasa semicuantitativa Tolerancia a NaCl al 5% Hidrlisis del Tween 80 Produccin de niacina Reduccin de nitratos Reduccin de telurito Catalasa semicuantitativa Hidrlisis del Tween 80 Ureasa

Fuente: Hernandez, 2000

PRUEBAS MOLECULARES
Sondas de cidos nucleicos Secuenciacin de cidos nucleicos

Polimorfismo de fragmentos de restriccin (PRA)

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin

(RFLP)
Tipiaje de oligonucletidos espaciadores

(Spoligotyping)

Micobacterias ambientales

Micobacterias ambientales o no tuberculosas

Ampliamente distribuidas en la naturaleza: agua, suelos,

plantas, etc.
Usualmente no infectan al hombre

Las enfermedades causadas son llamadas micobacteriosis

Factor predisponente: inmunocompromiso local o sistmico

Infecciones por micobacterias atpicas posterior a mesoterapia

Dr. Armando Guevara Lic. Ismar Rivera Lic. Arnelly Escalona Dr. Jacobus de Waard

Mesoterapia
Tratamiento alternativo
Control de sndromes dolorosos Inyecciones VID 0,05 - 0,1ml Uso actual: Afecciones cutneas Esttica

Objetivo
Caracterizar desde el punto de vista clnico,

epidemiolgico y microbiolgico a pacientes con

infeccin posterior a mesoterapia, que acudieron al

Laboratorio de Tuberculosis del Instituto de Biomedicina

entre Marzo 2002 y Diciembre 2003.

METODOLOGA

Metodologa
Pacientes:
Pacientes con lesiones nodulares y abscedadas posterior a mesoterapia Ficha clnica: identificacin, descripcin de lesiones, cultivos previos, lugar y fecha del procedimiento, responsable de mesoterapia

Metodologa
Procesamiento microbiolgico: Muestras

Baciloscopa (Zielh Neelsen)

Inoculacin en medios para micobacterias

Identificacin de cepas recuperadas por PCR:

Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restriccin del gen hsp65 (PRA)

Metodologa
Investigacin de fuente de infeccin: 15 sustancias para mesoterapia

Medios de cultivo para bacterias de crecimiento

rpido, micobacterias y hongos

Identificacin de cepas recuperadas:

Mtodos clsicos Por PCR (PRA)

RESULTADOS

2% Femenino Masculino 98%

Pacientes evaluados segn sexo. Laboratorio de Tuberculosis. Instituto de Biomedicina. Marzo 2002-Diciembre 2003

Clnica
Inicio de sntomas:
2 a 8 semanas Regiones afectadas Cara Cuello Muslos Glteos Abdomen

Relacin epidemiolgica entre pacientes

21 pacientes agrupados en brotes 15 pacientes 4 pacientes 2 pacientes Cada brote: Pacientes tratados por misma persona Con el mismo producto Se aisl la misma especie

39% Si No 61%

Pacientes evaluados segn tratamientos previos recibidos. Laboratorio de Tuberculosis. Instituto de Biomedicina. Marzo 2002-Diciembre 2003

Estudios Bacteriolgicos
Previos:
Se realizaron en 29 pacientes 82,5% resultado negativo

Durante investigacin:
Todos negativos

Estudios para micobacterias

Baciloscopa:
Valor escaso: 8% positivas (4/49 pacientes)

Cultivo:
81,6% positivos (40/49 pacientes)

Muestra ideal:
Secrecin de abscesos cerrados

Identificacin de micobacterias aisladas

Polimorfismo de longitud de Fragmentos de Restriccin del gen hsp65 Colonias de micobacterias

5% 3% 3% 10%

54% 25%

M. abscessus M. fortuitum M. chelonae M. peregrinum M. simiae M. cosmeticum

Especies de micobacterias aisladas en pacientes con infeccin posterior a mesoterapia Laboratorio de Tuberculosis. Instituto de Biomedicina. International Journal of Systematic and Marzo 2002-Diciembre 2003 Evolutionary Microbiology (2004), 54 (6): 2385-91

Mycobacterium cosmeticum sp. nov., a novel rapidly growing species isolated from a cosmetic infection and from a nail salon

Tratamiento y evolucin
Tratamiento especie especfico

Resistentes a antituberculosos
Tratamiento por 6 a 16 meses

Tratamiento y Evolucin
M. fortuitum: Ciprofloxacina + Amikacina mantenimiento con Ciprofloxacina

M. abscessus: Amikacina + Claritromicina

mantenimiento con Claritromicina.

M. chelonae: Tobramicina + Claritromicina

mantenimiento con Claritromicina
Brown-Elliott BA, Wallace RJ. Clin Microbiol Rev. 2002. 15(4):716-46.

Tratamiento y Evolucin
M. peregrinum: Ciprofloxacina + Amikacina

mantenimiento con Ciprofloxacina M. simiae: Claritromicina M. cosmeticum: Ciprofloxacina

Brown-Elliott BA, Wallace RJ. Clin Microbiol Rev. 2002. 15(4):716-46.

Tratamiento y Evolucin
Recadas frecuentes Cicatrices retrctiles, hiperpigmentadas con depresiones centrales

Lesin en muslo luego de 8 meses de tratamiento

Fuente de Infeccin
15 productos:

Formulas magistrales
L-carnitina Lidocana Silicio orgnico Extracto de alcachofa

Fuente de infeccin
Cladosporium sp
Aspergillus terreus Rodothorula rubra Enterobacter agglomerans Burkholderia cepacea

Serratia odorifera
Mycobacterium abscessus M. fortuitum

Frasco de lidocana del cual se aisl M. fortuitum

10% 14% 45% Mdico Cosmetlogo Amigos Entrenador

31%

Pacientes evaluados segn persona que administr la mesoterapia. Laboratorio de Tuberculosis. Instituto de Biomedicina. Marzo 2002Diciembre 2003

Conclusin
Terapias alternativas tienen alto riesgo Lesiones que no respondan a tratamiento convencional podran ser causadas por micobacterias