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COMPLEJIDAD Y
HETEROGENEIDAD CELULAR
DEL SISTEMA INMUNE
COMPLEJIDAD Y
Linfocitos
R1
Monocitos
I) MARCAJE SUPERFICIAL
I) MARCAJE SUPERFICIAL
I) MARCAJE SUPERFICIAL
FICT CD3 T
PE CD56 NK
PerCP CD19 B
I) MARCAJE SUPERFICIAL
Dobles negativos
Simples positivos
Dobles positivos
Triples positivos
I) MARCAJE SUPERFICIAL
I) MARCAJE SUPERFICIAL
- Caracterizacin fenotpica: CD3, CD56, CD19 - Diferenciacin celular: CD95, CD45RA, CD45RO - Coestimulacin: CD28, ICOS, CTLA-4 - Recirculacin: CD62L, CLA, a4b7 - Activacin celular: CD57, CD25, HLA-DR, CD71
Marcaje superficial
Fijacin
Permeabilizacin
Marcaje
intracelular
Citocinas intracelulares
CD4
Y
Permeabilizacin
Y Y Y Y
Anti-CD8 PE-Cy5
Y Y
Anti-CD4 FITC
Y
Anti- IFN gamma Anti- IL 2 Anti- IL 4
PRODUCCION DE IL-6 POR LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO
CONTROL
R1= MONOCITOS CONTROL NEGATIVO (GATE R1) EXPRESION DE IL-6 (GATE R1)
0.1%
0.22%
R1
0.3%
R1
33.8%
PE
Clulas en proliferacin
- Marcaje intracelular:
* Molculas implicadas en control del ciclo
celular: ciclinas
* Secrecin de factores de crecimiento:citocinas
G0/G1
S
2n
2n-4n
G2/M
4n
Fijacin
Permeabilizacin
G0/G1
M1
S G2/M
M2 M3
2n
4n
IV) HISTORIAL DE
DIVISIONES: CFSE
- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)
- Sonda fluorescente que se une a protenas intracelulares y que se reparte por igual entre las clulas hijas
R3
R2
Proliferantes
V) ENUMERACIN CELULAR
- Los mtodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las clulas que estn proliferando
- Este mtodo ratiomtrico permite calcular el nmero absoluto de clulas con respecto a las que sembramos inicialmente
CULTIVOS CELULARES
Clulas
Medio
PHA
ENUMERACIN CELULAR
R2
Tras cultivo
R1
Crecimiento
Basal
R2 R1 Muerte celular R2
R1
R2
ENUMERACIN CELULAR
Crecimiento
Tras Cultivo
Apoptosis
V) ENUMERACIN CELULAR
Basal
Crecimiento
R1 R8
R1
R8
Apoptosis
x = 100.000 cls
R1
ESTUDIO DE LA APOPTOSIS
ESTUDIO DE LA APOPTOSIS
0) Caractersticas de la apoptosis I) Tamao celular II) Marcaje con anticuerpos monoclonales III) Permeabilidad a sondas fluorescentes que se unen al DNA IV) Extraccin de DNA de bajo peso molecular V) TUNEL VI) Aumento de fosfatidilserina VII) Medida del potencial de la mbra mitocondrial VIII) Disminucin de F-actina IX) Apostaina
APOPTOSIS
-La apoptosis es un modo de muerte celular activo y fisiolgico en el que la clula ejecuta el programa de su propia muerte
INDUCCIN DE LA APOPTOSIS
Apoptosis
Programada genticamente Disminuye
Necrosis
Accidental Aumenta
Se mantiene
Se preservan Temprana
Se pierde
Se desintegran Tarda
Restos celulares
Temprana Tarda en fragmentos en fragmentos grandes oligonucleosomales En cuerpos apoptticos Los contenidos . rodeados por membrana de los orgnulos se liberan Son reconocidos Inducen y fagocitados inflamacin local
I) TAMAO CELULAR
La deshidratacin y el plegamiento de la membrana plasmtica causan una disminucin de FSC y un aumento de SSC
R1
No viables
R3 R4
Viables
Viables
No Viables
No Viables
M1
Diploide (2n)
Viables
M1
M1
M2
M2
Viables
Apoptticas tempranas
5
TIEMPO (min)
10
+
E. Coli
FITC
ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA DE LOS GRANULOCITOS (CD15+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCK SEPTICO Control
R1=Granulocitos Control negativo (R1)
0.84%
R1
57%
LOS MONOCITOS (CD14+) DE SANGRE PERIFERICA DE PACIENTES CON SHOCKSEPTICO PRESENTAN UNA ACTIVIDAD FAGOCITICA DISMINUIDA Control
R1=Monocitos Control negativo (R1) E. Coli Positivo (R1)
2 .2 5 %
8 1 .2 8%
R1
R1
O2
H 2O 2 SOD Cl
-
O2
Fe
3+
O2 * OH OH H 2O
OCl
Catalasa
H 2O 2
Mieloperoxidasa Glutation peroxidasa
+
MACRFAGO GRANULOCITO
NO FLUORESCENTE
FITC
R1
R2
Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.005 Sample ID: W.B Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 2155 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events % Gated 0 0.00 64 2.97 0 0.00 2091 97.03 % Total 0.00 1.60 0.00 52.34 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G1 Total Events: 3995 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)
X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean *** *** *** *** 708.08 683.15 43.09 19.03 *** *** *** *** 675.00 657.90 5.11 5.01
R1
R2
Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.005 Sample ID: W.B Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 115 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events % Gated 0 0.00 5 4.35 14 12.17 96 83.48 % Total 0.00 0.13 0.35 2.40 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G2 Total Events: 3995 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)
X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean *** *** *** *** 273.80 270.20 11.53 11.47 112.14 110.25 5.43 5.21 230.90 225.56 5.68 5.54
R1
R2 Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.006 Sample ID: E.Coli Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 5843 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events 0 552 0 5291 % Gated 0.00 9.45 0.00 90.55 % Total 0.00 5.52 0.00 52.91 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G1 Total Events: 10000 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)
X Mean X Geo Mean Y Mean Y Geo Mean *** *** *** *** 686.71 665.12 276.84 53.29 *** *** *** *** 690.27 674.45 5.14 5.02
R1
R2 Quadrant Statistics File: Oxi RMC-3.006 Sample ID: E.Coli Tube: Acquisition Date: 9-Dec-98 Gated Events: 300 X Parameter: SSC-H SSC-Height (Linear) Quad Location: 148, 10 Quad UL UR LL LR Events % Gated 1 0.33 62 20.67 48 16.00 189 63.00 % Total 0.01 0.62 0.48 1.89 X Mean 136.00 252.52 109.17 232.49 Log Data Units: Linear Values Patient ID: 10 Panel: Gate: G2 Total Events: 10000 Y Parameter: FL1-H Rodamina (Log)