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ANÁLISIS DEL ADN CROMOSÓMICO

MEDIANTE MACRORRESTRICCIÓN:
ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSANTE
(PFGE)
Q.C. Miguel Ángel Ortiz Gil.
Instituto Nacional de Salud Publica – Centro de Investigación Sobre
Enfermedades Infecciosas.
EPIDEMIOLOGÍA
MOLECULAR
• Se aplica en enfermedades infecciosas.
• Combina los métodos moleculares y
epidemiológicos.
• Su función es identificar agentes
patógenos, su distribución y sus factores
de riesgo.
EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
¿CUÁL ES LA IMPORTANCIA DE APLICAR
PFGE?

• Identificar el patógeno
• Determinar el origen o fuente
• Demostrar que el patógeno proviene de la fuente
• Describir la transmisión
• Dar información segura y a tiempo

Desarrollar estrategias de intervención

Reducir y controlar la presencia


y diseminación del patógeno
TIPIFICACIÓN MOLECULAR
• Su función es comparar la composición
de los ácidos nucleicos de dos o más
microorganismos.
• Para reconocer la relación entre
aislamientos vinculados
epidemiológicamente y, por tanto,
derivados recientes de un
microorganismo precursor común.
CLASIFICACIÓN DE
MÉTODOS MOLECULARES
• Análisis de DNA extracromosómico
• Restricción de DNA cromosómico y detección de secuencias
por hibridación con sondas
• Macrorrestricción de DNA cromosómico  PFGE
• Amplificación de secuencias genéticas con o sin restricción
posterior del producto obtenido
• Análisis de DNA por secuenciación
• Perfil de hibridación de múltiples secuencias.

• La elección de la técnica a aplicar


dependerá de la capacidad técnica y
FUNDAMENTO DEL PFGE
• Tiene como objeto reconocer la relación
epidemiológica entre aislados y, por tanto,
derivados recientes de un microorganismo
ancestral común.
• Mediante esta técnica separamos fragmentos
de ADN cromosómicos de elevado tamaño
mediante una técnica especial de
electroforesis, en la que se aplican campos
eléctricos de incidencia pulsante.
ETAPAS EN EL PFGE
1. Extracción del DNA cromosómico
bacteriano.
2. Restricción del DNA, utilizando enzimas
de restricción de baja frecuencia de
corte.
3. Separación de los fragmentos obtenidos
mediante PFGE.
EXTRACCIÓN DEL ADN CROMOSÓMICO
BACTERIANO
CRECIMIENTO BACTERIANO

• Los microorganismos se pueden obtener a


partir de un cultivo.
• Estandarizar el inoculo mediante
espectrofotometría ésta será una medida
indirecta de la concentración de DNA.
• Se mezcla el inoculo con agarosa. De esta
manera conseguimos inmovilizar un número
de células bacterianas.
• La agarosa en la que se encuentran
embebidas las células permite fluir a su
través las soluciones de lisis o restricción, y a
la vez va a proteger las moléculas de DNA de
EXTRACCIÓN DEL ADN
CROMOSÓMICO BACTERIANO
LISIS
• Los bloques se sumergen en una solución
de lisis que contenga los enzimas
precisos para romper las células.
• La composición de la solución de lisis es
variable en función de la especie
bacteriana con la que estemos
trabajando.
EXTRACCIÓN DEL ADN
CROMOSÓMICO BACTERIANO.
LAVADOS
• Una vez que las células están lisadas es
preciso someter a los bloques a
sucesivos lavados con una solución TE
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA ).
• El objetivo de los lavados es arrastrar
fuera del bloque de agarosa restos
celulares procedentes de la lisis, así
como eliminar componentes que puedan
inhibir la restricción posterior (proteinasa
K, detergente o EDTA).
RESTRICCIÓN DEL DNA
• La actividad de los enzimas de restricción viene
definida sobre ADN en ausencia de agarosa.
• La presencia de agarosa conlleva inhibición de la
reacción de digestión, por tanto es preciso aumentar
el número de unidades de enzima y el tiempo de
incubación.
• Una enzima de restricción para PFGE debe generar
pocos fragmentos de DNA y estos sean de gran
tamaño.
• Las enzimas con un lugar de restricción rico en G+C,
son adecuados para tratar el DNA bacteriano de
especies con genoma rico en A+T y, a la inversa.
SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS
OBTENIDOS MEDIANTE PFGE.
• En un campo eléctrico, las moléculas de ADN
se reorientaban y se desplegaban avanzando
en dirección al polo positivo.
• La aplicación de un segundo campo eléctrico,
con una orientación distinta del primero,
obligaba al DNA a cambiar su conformación y
reorientarse de nuevo para poder avanzar en
la dirección del segundo campo eléctrico.
• Mientras los campos eléctricos que se
alternen tengan la misma intensidad y
voltaje, la migración final del ADN se
recogerá en forma de línea recta.
SEPARACIÓN DE LOS FRAGMENTOS
OBTENIDOS MEDIANTE PFGE.
• CHEF (clamped homogeneous electric field
electrophoresis), sistema con veinticuatro
electrodos y en un contorno hexagonal.
• El voltaje generado por la fuente de
electroforesis se divide entre los electrodos,
crea un gradiente constante a lo largo de
todo el gel.
• El ángulo de reorientación debe ser superior a
90º, habitualmente se trabaja con ángulos de
120º
COMPONENTES DE UN
SISTEMA DE PFGE.
• Unidad de control de pulsos-generador de
corriente., controla los 24 electrodos y la duración
de la alternancia de los pulsos eléctricos.
• Cubeta de electroforesis. Es una cubeta acrílica
en la que se encuentran los 24 electrodos
distribuidos en forma hexagonal.
• Bomba de recirculación del tampón. Aspira el
tampón de electroforesis de la cubeta, lo empuja a
través de la unidad de refrigeración y lo devuelve a
la cubeta.
• Unidad de refrigeración. Suele ser un aparato de
refrigeración portátil.
VARIABLES QUE AFECTAN A LA
RESOLUCIÓN DEL PFGE
• Las condiciones para obtener la mejor
resolución por PFGE están, por supuesto, en
función del rango de tamaño de las moléculas
a separar y del enzima de restricción
seleccionado.
• También intervienen variables técnicas como
la duración y alternancia de los pulsos
eléctricos, el voltaje, la temperatura de la
cubeta, el tiempo de electroforesis, el tampón
utilizado o el ángulo de reorientación.
CRITERIOS PARA LA
INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS
• Examinar la colección completa de cepas a
estudiar en busca de un patrón epidémico,
que sería el más común entre los
aislamientos.
• A continuación todos los otros patrones
deben compararse con éste y a la vez entre
sí. Es preciso contabilizar el número de
fragmentos distintos de cada cepa con todas
las demás, fragmento a fragmento
CLASIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS
BASAD0S EN PFGE
• Idénticos. Cuando los dos aislamientos
presentan el mismo número de bandas y
éstas tienen aparentemente el mismo
tamaño.
• Genéticamente relacionados. Cuando el
número de diferencias entre los dos
aislamientos sea inferior o igual a 3. En este
caso, un subtipo de la otra o ambas derivadas
de un ancestro común.
CLASIFICACIÓN DE AISLAMIENTOS
BASAD0S EN PFGE
• Posiblemente relacionados. el número de
cambios puede llegar a ser hasta de 6.
Aunque estos aislamientos puedan también
corresponder a una línea evolutiva común, su
relación genética no es tan cercana y por
tanto, es menos probable su relación
epidemiológica.
• No relacionados. Un número de diferencias
entre los dos patrones superior a 6. Sin
relación epidemiológica.
INCONVENIENTES DE LA
TÉCNICA
• Existen algunas especies bacterianas en las
que la degradación del ADN cromosómico
hace que muchas de sus cepas sean "no
tipables" por PFGE. Este es el caso de
algunas subespecies de Salmonella, algunas
cepas de Pseudomonas aeruginosa,
Clostridium difficile o algunos patógenos
entéricos (E. coli).
• Un inconveniente importante es el derivado
de la interpretación de los patrones de
bandas obtenidos, que es subjetiva en la
mayoría de los casos, y de la ausencia de un
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN.

• Bibliografía:
- Pere Coll et al. Métodos moleculares de
tipificación epidemiológica en bacteriología.
Procedimientos en Microbiología Clínica.
Recomendaciones de la Sociedad Española
de Enfermedades Infecciosas y Microbiología
Clínica.
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/indice18.htm