Billie C. C. Residente de Microbiologa.

INTRODUCCION

El cultivo de tejidos se desarroll a partir de los ltimos aos del siglo XIX como una continuacin de las tcnicas de la embriologa. Wilhem Roux mantuvo en el ao 1885 clulas de embrin de pollo en solucin salina durante unos das. El zologo americano R.G. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907. En los ltimos aos la aplicacin de la tecnologa del cultivo celular ha permitido grandes avances en la comprensin de los mecanismos implicados en los procesos intracelulares e intercelulares.

Cultivo Celular:

Los cultivos de clulas in vitro consisten en un sistema formado por : cl. provenientes de un rgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en medios de cultivo de composicin qumica definida y en condiciones de temperatura, pH, aireacin y humedad controladas. De esta forma se aseguran su supervivencia y multiplicacin, manteniendo todas sus funciones metablicas de una manera semejante a las que tenan en el husped.

Aislamiento Viral:

Ventajas:

Control del medio fisicoqumico: pH, t, pr. Osm., tensin de O2 y gas carbnico (CO2) de las cl. cultivadas y, las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes. Los cultivos de clulas permiten someter a las mismas a una baja y definida [ ] de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyeccin del reactivo in vivo, su excr. y su posterior distribucin a los tejidos en estudio. Permiten el estudio del transporte y la utilizacin de metabolitos.

AISLAMIENTO VIRAL

Desventajas:

Requiere das a sem. para la obtencin del rtdo. Requiere niveles de seguridad 2,3 o 4. Frecuentemente tienen baja sensib. lo que depende en gran medida de la cond. muestra. Susceptible de contam. bact. y de sust. txicas.

Cultivo Celular

Directo

Indirecto s

Clasificacin de Cultivos Celulares.

Cl. Primarias: Tej. Animales (tripsina). Cl. Secun. : Cl. Prim. subcultivados varias veces (misma constitucin cromosmica que el de origen y capaces de un nmero de subcultivos limitado). Lneas Semicontinuas: Cl. embrionarias, configuracin cromosmica diploide y no se subcultivan indefinidamente.

Lneas cel. Heteroploides: Subcultivadas indefinidamente y morfologa cromosmica.

Alt. en n

PRIMER PASO A SEGUIR: La 1era decisin a tomar es saber que lneas celulares vamos a emplear. Cuanto ms rpido es la aparicin del efecto citoptico (CPE) ms rpido es el diagnstico.

LINEA CELULARES

TEJIDO DE ORIGEN

VIRUS QUE PUEDEN SER AISLADOS EN CADA TIPO CELULAR Herpes simplex, Enterovirus, Poliovirus, Adenovirus. Herpes y Adenovirus bovino, estomatitis vesicular. Influenza, Adenovirus

HEp-2 MDBK MDCK MRC-5 Vero

Carcinoma epidermoide de laringe humana Rin bovino Rin canino

Pulmn embrionario humano Citomegalovirus Rin de mono Herpes y Poliovirus

BHK-21
HeLa

Rin de hamster
Carcinoma de cervix humano Cel. Tumorales pulm humanas. Cel. Rion mono

Estomatitis vesicular y fiebre aftosa

Poliovirus, Adenovirus

A-549
BGM

VSR, ADN y POL.

VHS y ENT.

MEDIOS DE CULTIVO...

MEM

Medio de crecimiento

Medio de mantenimiento

Medios selectivos

Medios de congelacin

Requerimiento Mnimo

MEM

MEM

Tipo de clulas

MEM

SSB, a.a. vitaminas

10-15%

2% SFB

Propsito del cultivo

50% SFB

Base para los dems medios

SFB

Intervalo de subcultivos

Crecimiento utilizacin

8% dimetil sulfoxido

FACTORES BASICOS PARA LA SUPERVIVENCIA CELULAR...

CO2 Presin osmtica pH SSB

Oxigeno Agua

Vitaminas
A.A. Suero

Aminocidos

Vitaminas

Sales

Otros compuestos*

Protenas requeridas en los medios definidos libres de suero

Arginina Cistena Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Biotina Colina Folato Nicotinamid a Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina

NaCl KCl NaH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgCl2

Glucosa Penicilina Estreptomicina Anfotericina Rojo fenol Suero fetal bovino

Insulina Transferrina Factores de crecimiento especficos

Tabla 1. Requerimientos moleculares de un medio de cultivo para virus.

OBTENCIN DE LAS CLULAS..

CONTAMINACIN DE LOS CULTIVOS CELL...

La contaminacin puede tener varios origenes: Tejidos originales. Productos biolgicos (suero mycoplasma R a penicilina). El personal del laboratorio con su propia flora. Del medio ambiente (laboratorio- material).

Cuando esta presente en cultivos celulares, no siempre resulta en alteraciones microscpicas de las clulas o del medio; muchas infecciones crecen lentamente y pueden tener los siguientes efectos:

Uninfected cell cultures and cell cultures showing CPE of viruses commonly isolated. (A) Uninfected A549 cells; (B) HSV-2 in A549 cells; (C) adenovirus in A549 cells; (D) uninfected MRC5 fibroblasts; (E) CMV in MRC-5 fibroblasts; (F) rhinovirus in MRC-5

Detection of HSV-1 and HSV-2 in ELVIS cells. (A) Blue cells positive for HSV with X-Gal stain; (B) immunofluorescence of uninoculated ELVIS cells; (C) HSV-1positive ELVIS immunofluorescence (note nuclear pattern); (D) HSV-2-positive ELVIS immunofluorescence

CONCLUSIONES: