AMPLIFICACIN DE DNA IN VITRO: PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

UROLOGA DR. CALVO JUAN CARLOS SORIA MATURINO

PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin
en cadena de DNA utilizando un termociclador.

El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de

DNA.

Se

realiza la amplificacin de un segmento especfico de DNA, teniendo poco material disponible.

POLIMERASA CHAIN REACTION: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Fue diseada por el Dr. Kary Mullis en
1987.

Gan el premio Nbel de Qumica en

1993 por su invento.

Utilizo el PCR para amplificacin del

gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

TERMOCICLADOR
La

PCR se realiza en un Thermo Cycler Termociclador.

Es

una mquina que calienta y enfra la reaccin en periodos cortos de tiempo.

Tras la extraccin del DNA a partir de un tejido se obtiene el DNA total contenido en el conjunto de clulas del tejido utilizado.

Este DNA se puede observar como un precipitado, que es posible suspender en agua.

La importancia de la PCR es que nos permite generar muchas copias de un fragmento de DNA y distinguirlo del resto del DNA extrado.

COMPONENTES DE LA PCR
DNA MOLDE Iniciadores: Molculas cortas (10 a 30 bases) de cadena sencilla. CEBADORES O PRIMERS

DNA POLIMERASA nos permitir generar la copia)

Cofactores Cationes divalentes: MgCl2

Nucletidos libres: dNTPs desoxirribonucleicos trifosfato

BASE TERICA

Partiendo de una DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucletidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unin de los cebadores al molde.

Se lleva a cabo en 3 fases:

Desnaturalizacin Hibridacin Elongacin

Desnaturalizacin

Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en

hebra sencilla.
-Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma-

Hibridacin:

Los cebadores primers previamente diseados,

reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores segn sea el caso. (Temp. 35-60)

Elongacin
Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde Se efecta a 70C por 1 minutos. La temperatura vara segn la enzima utilizada por ejemplo para Taq polimerasa es en 72C.

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

 Estas 3 fases constituyen un ciclo. nicamente una copia de un

pequeo fragmento del DNA molde se originado en el primero. La PCR se completa repitiendo entre 25-35 veces /ciclos las tres fases descritas.

Tras varios ciclos se forman fragmentos cuyo tamao est

limitado por los puntos en los que hayan hibridado los cebadores.

 ESPECIFICIDAD DE LA REACCIN DE PCR

Depende fundamentalmente de la temperatura empleada en

la fase de hibridacin y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reaccin. Cuanto mayor sea la temperatura utilizada en esta fase ms especfica es la reaccin.

Se debe a que a mayor temperatura ms dificultada se ve la

unin entre el cebador y la cadena molde, en condiciones de temperaturas de hibridacin elevadas el cebador slo se unir a la cadena molde si son complementarios en todos sus nucletidos.

 En un determinado rango, incrementos en la concentracin de

MgCL2 hacen disminuir la especificidad de la reaccin; los iones facilitan la unin del cebador a la cadena moled y permiten la incorporacin de los nucletidos a la cadena creciente.

EN EL PCR HAY UNA AMPLIFICACIN EXPONENCIAL

Polimerasa

En un principio, la polimerasa de DNA que

se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que haba que aadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Se

reemplazo la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus conocida como Taq pol

ANLISIS DE LA MUESTRA
La
deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico. Dependiendo del tamao de la amplificacin y la resolucin que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

ANLISIS DE LA MUESTRA
La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio (lmpara de luz UV), tincin de plata, fluorescencia, radioactividad

Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecficos se pegan a varios sitios)

APLICACIONES
Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros

Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, anlisis de fsiles

Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin contenida a travs de primers con mutaciones)

Investigacin forense Pruebas de paternidad

Criminalstica

Ejemplo de un caso de

criminalstica resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.

Si se observan los patrones

bandas podr comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V)

VENTAJAS DEL PCR

A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense, diagnsticos, anlisis prenatales, etc.

DESVENTAJAS DEL PCR

Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb.

Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)

 Bibliografa: Higuchi, R.; Fockler, C.; Dollinger, G.; Watson, R. 1993.

Kinetic PCR analysis: realtime monitoring of DNA amplification reactions. Bio/Technology 11: 1026-1030.

Reaccin en casdena de la polimerasa Gmez. Rev

Universidad Politcnica de Valencia 2012