Que es la luz?

: Radiacin electromagntica visible

Teora corpuscular Dualidad onda-corpsculo

Teora ondulatoria

Fotn: Tiene propiedades corpusculares y ondulatorias Partcula que porta las distintas formas de radiacin electromagntica; tiene masa cero y en el vaco tiene velocidad constante.

- En fenmenos de reflexin y refraccin, el fotn se comporta como una onda. - En fenmenos de transferencia de energa, el fotn se comporta como un corpsculo, donde la energa esta dada por:

Espectro electromagntico

hc E= l
h: constante de Plank C: velocidad de la luz en el vacio. l: longitud de onda

Propiedades de la luz desde un punto de vista ondulatorio

Parmetros utilizados para definir una onda:

Amplitud, A: intensidad de la energa. El ojo percibe la A como brillo.

Longitud de onda, l: Distancia entre 2 mximos de una onda. Este parmetro determina el color de las cosas.

Frecuencia, F: Nmero de vibraciones por segundo de una onda.

Velocidad, v: se calcula usando la longitud de onda la frecuencia.

V= x f

Fenmenos de la luz
Refraccin: cambio de direccin de la luz cuando incide por un cuerpo con densidad distinta, sufriendo un retraso en su velocidad.

Velocidad de la luz en el aire ndice de refraccin: Velocidad de la luz en el medio

Fenmenos de la luz
Reflexin: cuando la luz incide en superficies como un espejo, el rayo se refleja (no penetra)

Fenmenos de la luz
Dispersin: cambio en la velocidad de un rayo incidente sobre un medio en particular. Todas las radiaciones tienen la misma velocidad en el vaco. Al incidir en un medio diferente, sus velocidades cambian y esta velocidad (en el nuevo medio) depende de la longitud de onda.

Uso de microscopia en biologa celular

Problemas bsicos en biologa celular

Donde se expresa la protena? Cuando se expresa la protena? Donde y cuando mi protena interactua con otra protena? Cuanto de mi molcula hay disponible? Que cantidad de mi molcula se encuentra en un lugar determinado y en que momento?

Herramientas bioqumicas y de biologa molecular (entre otras) pueden ayudarnos a contestar estas preguntas pero existen algunos detalles...

Cambios en la expresin de la protena X al tratar clulas con el compuesto Y a diferentes concentraciones. Compuesto Y ng/ml

Proteina X
Actina

Todas las clulas aumentan la expresin de X?

Esquema de la expresin de protena X (azul) analizada por el inmunoblot anterior: se puede hablar de expresin heterognea mediante este mtodo?

Bioqumica vs imagen

Las clulas se pueden ver mediante instrumentos que manipulen la luz: microscopios

Jugando con las propiedades antes mencionadas se puede: 1.- modificar el recurso/enfoque de luz 2.- iluminar las clulas 3.- seleccionar la luz que se emita o transmita de la clula 4.- detectar la luz necesaria

Concepto de resolucin: habilidad para distinguir dos puntos

d: espacio entre dos partculas adyacentes, l: longitud de onda de iluminacin, NA: apertura numrica del objetivo

Apertura numrica (NA): uno de los parmetros ms importantes en microscopa

-Cuanto mayor sea la AN, mayor ser la resolucin.
-Cuanto mayor sea el ngulo de la lente para recibir la luz, mayor ser su poder resolucin. -El poder de resolucin: La capacidad de un objetivo para resolver dos lneas o puntos que se encuentran muy juntos -Cuanto mayor sea la AN, ms corta es la distancia de trabajo

Light cone

NA=n(sin )

n= el ndice de refraccin ms bajo entre el objeto y el objetivo, generalmente 1. es 1/2 de la apertura angular del objetivo

Magnificacin: hacer que las cosas parezcan ms grandes de lo que son.

Magnificacin = resolucin /

Microscopia ptica: tipos de microscopios

Microscopia de campo claro: se utilizan tinciones

Clulas de cebolla

Rotfero

Microscopa de campo oscuro

Slo la luz refractada (desviada) o difractada (dispersa) participa en la formacin de la imagen.

Ventaja: se visualizan objetos pequeos como bacterias que refractan la luz. Desventajas: la resolucin no es muy alta.

Glbulos rojos bajo microscopia de campo oscuro

Rotferos. A: campo oscuro, B: campo claro

Microscopa de contraste de fase

Diferencias en el ndice de refraccin o en el grosor de partes de la muestra, son convertidas en luz y oscuridad para formar la imagen final.

Uso: Muestras vivas sin teir. Deteccin de bacterias y algunos organelos grandes, pero no para distinguir la estructura interna de bacterias por ejemplo.

Microscopa de contraste de fase

Microscopio DIC (Differential Interference Contrast)

Se utiliza luz polarizada; para esto la luz pasa por un polarizador y luego por un prisma de Wollaston.
La luz forma 2 haces separados que atraviesan la muestra (rotando la polarizacin) y luego se juntan con el segundo prisma de Wollaston.

Las diferencias en el ndice de refraccin o de grosor en la muestra genera imgenes brillantes (rayos en fase) u oscuras (rayos fuera de fase)

La polarizacin de la luz ocurre cuando la luz atravieza ciertos filtros que permiten que pase slo la parte de la luz .

Contraste de fases

DIC

Clulas del epitelio bucal

Diferencia principal entre CF y DIC: bases pticas por las que las imgenes son formadas (contraste)

Microscopa de fluorescencia

Concepto de fluorescencia

Un cromforo absorbe luz pero no emite luz. Esto implica que el objeto tiene color Un fluorforo absorbe luz a longitudes de onda cortas y EMITE luz a longitudes de onda mayores.

Fluorforos

Ventajas: uso de fluorforos ha permitido la identificacin de compuestos sub-celulares con alta especificidad y sensibilidad (50 molculas/ micrmetro cbico). Disponibilidad de muchos fluorocromos. Usos: en material orgnico e inorgnico, material vivo, como sensor de cambios fisiolgicos (cambios en concentracin de iones), etc.

Actina (Alexa Fluor 488 )

-Tubulin Antibody (green). Actin filaments have been labeled with Alexa Fluor 555 phalloidin (red). Blue pseudocolor = DRAQ5 (fluorescent DNA dye).

mouse anti-NPCP (nuclear pore complex protein) and rabbit anti-giantin (Golgi complex) primary antibodies. The antibody targets were visualized with goat secondary antibodies conjugated to Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488, respectively

anti-Histone H2A.Z Polyclonal Antibody

Microscopa confocal
Se utiliza un lser que ilumina la muestra en un solo plano. Elimina la luz que viene de planos fuera de focos (toma solo un plano focal y se eliminan los restantes)

(A). Imagen de microscopa ptica de fluorescencia de un alga (Spyrogira). (B) Imagen del mismo tipo de muestra (Spyrogyra) obtenida con el microscopio confocal.
ngel Martnez Nistal, Microscopia confocal, U. de Oviedo

Ventajas de la microscopa confocal

Reduccin de imgenes borrosas producto de la dispersin de la luz Incremento en la resolucin efectiva Mejora la relacin seal / ruido Examina de forma clara muestras gruesas Escaneo en eje Z Percepcin de profundidad en las imgenes seccionadas en Z Magnificacin se puede ajustar electrnicamente

Reconstruccin 3D

Reconstruccin 3D

Microscopia electrnica
Fuente de iluminacin: electrones, los que inciden en la muestra enfocados por campos electrostticos. Permite la observacin en una escala de nanmetros a micrmetros.

-Los electrones se hacen pasar por un vaco

- posteriormente se aceleran hacia la muestra con un potencial positivo,

- La muestra irradiada con electrones de la misma energa, hace variar el haz original y estas diferencias son detectadas para formar la imagen.

Electrones sobre una muestra: Dispersin elstica; solo cambios en trayectoria (energa cintica y velocidad permanecen constantes) e inelstica; algunos electrones pueden chocar y sacar a electrones de sus rbitas en la muestra (estado excitado)

SEM

TEM

TEM Las muestras se cortan en secciones delgadas (<100 nm) para permitir que los electrones pasen a travs de ella. Se usan metales pesados para dar contraste adicional los que se unen a ciertas estructuras. Los electrones solo pasan por las zonas donde no hay metales asociados Uso: para ver estructuras internas como organelos, para ver contornos intactos, pequeas estructuras como virus, etc. SEM

La formacin de la imagen se logra a partir de los electrones que han sido desplazados al incidir en la muestra. Estos electrones emitidos se capturan con un detector y la informacin se convierte en una seal elctrica, amplificada y digitalizada, el resultado es una imagen topogrfica de la superficie de la muestra. Tambin otras seales son emitidas que se pueden utilizar usando detectores especficos. Uso: Medicina Forense (Anlisis morfolgico de pruebas), Botnica, Biomedicina y Medicina (Estudio morfolgico), geologa, estudio materiales, etc.

Mitocondria en seccin de tejido pulmonar

Polen

Organelos en polen de tabaco, AF: filamentos de actina; G: aparato de Golgi; Mi: Mitocondria; Mt: Microtbulos

Sangre humana

Microscopia de efecto tnel

Se usa punta conductora aguda donde se aplica un voltaje entre la punta y la muestra (aprox. unos 10 ). Los electrones fluyen a la muestra o viceversa. Se necesita que la muestra y la punta sean conductores o semiconductores. A partir de la densidad electrnica de la superficie se obtendr la imagen. Se pueden obtener imgenes con resoluciones muy altas (sub-angstrom).

Corral de tomos de Fe (48), radio: 71.3

Milmetro: 1 mm = 1 000 000 nm Micrmetro: 1 m = 1000 nm Angstrom: 1 = 1/10 nm Picmetro: 1 pm = 1/1000 nm Metro: 1 m = 1.000.000.000 nm

kilmetro: 1 km = 1.000.000.000.000 nm