Tcnicas inmunolgicas Tcnicas serolgicas

Principios de Diagnstico Inmunolgico Las enfermedades infecciosas pueden ser

diagnosticadas definitivamente solo por tres formas:

1) Demostrar la presencia en el paciente de un agente conocido capaz de provocar la enfermedad, por observacin directa en el material clnico obtenido del paciente o por cultivo de laboratorio (in vivo o in vitro)
2) Deteccin de un producto especfico del agente infeccioso (que no pueda formarse sin la presencia del agente) en el material clnico obtenido del paciente 3) Deteccin en el suero del paciente de una respuesta inmunolgica especfica dirigida contra el Agente infecciosos

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Categoras de la respuesta inmune

Respuesta inmune mediada por clulas

o Inmunidad Celular Respuesta inmune mediada por anticuerpos o Inmunidad humoral

Para determinar si se ha producido un anticuerpo contra un agente en particular, se investiga en el suero (o plasma) del paciente la presencia de anticuerpos El diagnstico de las enfermedades por la medicin de los niveles de anticuerpo en suero se denomina serologa

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos

Mecanismo determinado genticamente Dirigidos contra un antgeno o determinante

antignico (eptope) Los microorganismos pueden contener numerosos determinantes antignicos Habr por lo tanto numerosos anticuerpos para cada antgeno Muchos determinante antignicos requieren ser expuestos

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos

Los anticuerpos se unen a la superficie de los

patgenos para:
Facilitar su ingestin

por las clulas fagocticas (Anticuerpos opsonizantes u opsoninas)

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Contribuir a su destruccin por la accin ltica

del complemento (Anticuerpos fijadores de complemento)

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos

Aunque el ser humano produce varias

clases de anticuerpos los mtodos serolgicos han sido desarrollados para medir principalmente dos clases:
Inmunoglobulina M (IgM) Inmunoglobulina G (IgG)

Solo en un caso se han desarrollado mtodos para

detectar la Inmunoglobulina A (IgA): Toxoplasmosis

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos

IgG Se producen mas tardamente pero persisten mas tiempo. Dos imgenes especulares, formadas por dos protenas, con los sitios de fijacin para el antgeno en el extremo. Unin mas espedfica al antgeno (avidez)

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas de los Anticuerpos

IgM Es el primer anticuerpo producido en respuesta a un antgeno (infeccin reciente) Cinco protenas idnticas unidas por la cadena J Unin al antgeno menos avida. No fija complemento

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Respuesta humoral relativa frente a un estmulo antignico

Caractersticas generales de la respuesta inmune

Interpretacin de las pruebas serolgicas

El dogma central de la serologa es el

concepto de aumento de ttulo Ttulo de un anticuerpo es la recproca de la mayor dilucin de suero del paciente en la cual an se puede detectar el anticuerpo Pacientes con gran cantidad de anticuerpos tendrn ttulos altos Dos muestras de suero: perodo agudo y convalecencia. Se procesan pareados. Un aumento de ttulo de dos diluciones al medio (1:8 a 1:32) se considera diagnstico de infeccin reciente (aumento de cuatro veces el ttulo) En la actualidad se cuentan con metodologas que permiten manejar valores mas continuos, en ocasiones hasta en forma cuantitativa

Principios de los Mtodos Serolgicos

Reaccin Antgeno-Anticuerpo

La reaccin entre un antgeno y un anticuerpo dirigido especficamente contra l da lugar a un complejo antgeno anticuerpo

Utilizada ampliamente en los laboratorios para la deteccin y cuantificacin de gran cantidad de sustancias en diversos medios biolgicos.

Reacciones de Aglutinacin
Cuando el antgeno libre o unido a un soporte se enfrenta al anticuerpo, el complejo antgeno-anticuerpo resultante se observa como una aglutinacin El proceso tiene dos fases: unin reversible y aglutinacin por formacin de puentes entre los anticuerpos IgG divalentes o IgM multivalentes y los antgenos Los anticuerpos IgM son mas eficaces para aglutinar (Anticuerpos completos). Los anticuerpos IgG a veces producen entrecruzamientos (Anticuerpos incompletos) Se expresan como aumento de ttulo Dan fenmeno de prozona (aglutinacin aparente por exceso de antgeno o anticuerpo sin aglutinacin

Reacciones de Aglutinacin
Factores que influyen en las reacciones de aglutinacin Carga de las partculas Tipo de anticuerpo Concentracin de electrolitos Viscosidad Nmero de determinantes antignicos Se emplean tanto para la deteccin de antgenos como de anticuerpos. Se pueden hacer de dos maneras: directas o indirectas

Reacciones de Aglutinacin Directa

Para deteccin de antgenos Soporte particulado con anticuerpos adsorbidos Distintos tipos de tcnicas segn la naturaleza fsica de soporte

Aglutinacin al ltex: partculas de ltex fcilmente visibles Deteccin en LCR de antgenos de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae
Hemaglutinacin pasiva: hemates como soporte Coaglutinacin: bacterias muertas como soporte; Staphylococcus aureus expresa la Protena A capaz de fijar el Fc de los anticuerpos

Reacciones de Aglutinacin Directa

Para deteccin de anticuerpos
Se pueden hacer en tubo, portaobjetos, placa o pocillo de microplaca Se enfrentan las partculas microbianas (generalmente muertas) en suspensin con el suero del paciente. Si el suero del paciente posee anticuerpos frente a la bacteria, se forman agregados visibles en el fondo del tubo o en el porta o en fondo de la microplaca Deteccin de anticuerpos frente a Brucella (Reaccin de Huddleson) o Salmonella (Reaccin de Widal

Reacciones de Aglutinacin Indirecta Para deteccin de anticuerpos

Se adsorben los antgenos en un elemento partculado (partculas de ltex, gelatina o bentonita, o clulas como hemates humanos, ovinos o de pavo Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al suero del paciente. Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca Deteccin de Treponema pallidum, Echinococcus granulosus

Pruebas de Antiglobulina
Se puede utilizar el microorganismo entero o adsorbido a un soporte particulado. Se enfrentan estos elementos (antgeno + elemento particulado) al suero del paciente.

Se incuba la muestra con una anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (antigamma)

Se observa la presencia de agregados visibles en el fondo del tubo, porta o pocillo de microplaca. til para detectar anticuerpos incompletos, en especial en Brucelosis.

Reacciones de Inhibicin Basadas en la incapacidad de algunos microorganismos para realizar

determinadas actividades biolgicas en presencia de anticuerpos especficos. Las mas utilizadas son dos:
Inhibicin de la Hemaglutinacin

Algunos virus (Rubeola, Influeza, Parainfluenza, Parotiditis, Adenovirus) se unen a receptores de la superficie de los hemates provocando su aglutinacin.
Esta aglutinacin puede ser inhibida por la presencia de anticuerpos especficos en el suero del paciente Neutralizacin Algunos virus (poliovirus) no desarrollan su efecto citoptico habitual en clulas de cultivo celular cuando hay presentes anticuerpos especficos.

Pruebas de Fijacin de Complemento Se incuba suero del paciente con el antgeno. En presencia de anticuerpos
en el suero se forman complejos antgeno-anticuerpo.
Se aade una cantidad de complemento (todos los elementos). Si inicialmente se haban formado inmunocomplejos se produce la activacin del complemento , consumiendo todos los componentes del sistema. Si no hay inmunocomplejos todo el sistema permanece. Se agrega un sistema revelador constituido por hemates unidos a anticuerpos antihemates (hemolisina) Si hay complemento libre (ausencia de anticuerpos en la muestra) se fija a los complejos hemate-hemolisina y los eritrocitos de lisan. Se utiliza en laboratorios de referencia para diagnsticos de virus respiratorios

Reacciones de Precipitacin
Formacin de estructuras insolubles por unin ente el antgeno soluble y el anticuerpo especfico incapaces de permanecer en solucin El precipitado puede ser puesto de manifiesto mediante tcnicas de nefelometra o inmunoturbidimetra, que pueden a su vez ser adaptadas a autoanalizadores de qumica clnica o instrumentos especializados (nefelmetros o inmunoturbidmetros) Se pueden usar para determinar protenas reactantes de fase aguda como PCR o demostrar infecciones previas por Streptococcus pyogenes por AELO (neutralizacin ltica de estreptolisina O)

Tambin pueden ser observados por tincin en placas de agarosa

Inmunodifusin doble
Tcnica de Outcherlony Se enfrentan concentraciones conocidas de antgeno soluble con un antisuero problema en un medio gelificado Tras un perodo en el que se permite difundir a ambos elementos puede observarse en el caso de que existan anticuerpos, bandas de precipitacin que pueden ser identificadas a simple vista o mediante tincin proteica Se emplea en la prctica en la deteccin de anticuerpos frente a diversos hongos productores de neumonitis por hipersensibilidad

Inmunodifusin Radial
Tcnica de Mancini
Se disuelve el anticuerpo en el agar y se colocan en pocillos diluciones del antgeno.

Si se corre simultneamente una curva patrn puede cuantificarse por regresin la cantidad de antgeno.
Es mas til para para la deteccin de antgenos que de anticuerpos

Contrainmunoelectroforesis
Puede ser utilizada tanto para detectar antgenos como anticuerpos

Combina la electroforesis (migracin de antgenos y anticuerpos en un gel de agarosa por accin de un campo elctrico) con la precipitacin (formacin de lneas de precipitado en un gel de agarosa cuando se produce la reaccin antgeno-anticuerpo) El antgeno de carga negativa en medio alcalino migra hacia el anodo, es decir hacia los pocillos del anticuerpo. Los anticuerpos en estas mismas condiciones migran al polo negativo o ctodo.
Se emplea en la identificacin del Arco 5 de Echinococcus granulosus

Pruebas con Anticuerpos Fluorescentes Se utilizan anticuerpos conjugados con sustancias fluorescentes
(fluorocromos como el isotiocianato de fluoresceina o el naranja de acridina. Se observa la presencia o ausencia de fluorescencia observando con un microscopio de fluorescencia Dos variantes: Tcnica directa (para deteccin de antgenos): se fija la muestra en un portaobjetos con acetona, se agrega el anticuerpo marcado con el florocromo (inmunofluerescencia directa IFD). Deteccin de Pneumocystis carinii en esputo inducido Tcnica indirecta (para deteccin de anticuerpos): se agrega primero el suero del paciente sobre antgeno improntado en portaobjetos; en la segunda fase se incuba con anticuerpo anti humano marcada con fluorocromo (inmunofluorescencia Indirecta IFI)

Inmunohistoqumica enzimtica
Se usa el tejido del paciente, al que se le agrega anticuerpos marcados con enzimas.
Se revela el marcador y se observa la presencia o ausencia de color.

Usado para detectar antgeno, en ocasiones post mortem, por ejemplo pacientes infectados con Rabia

Inmunoensayos
Para detectar antgenos Metodologa ELISA Utilizan anticuerpos de captura pegados a un elemento fijo, portaobjetos, esfera de poliestireno, pocillo de microplaca, etc. Se aade la muestra problema con antgeno Se lava para eliminar otras protenas unidas en la muestra Se agrega un segundo anticuerpo contra el antgeno, unido a un marcador enzimtico (una enzima como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rbano picante) . Se agrega el sustrato de la enzima, que dar un color si haba antgeno unido Diagnstico de Chlamydia trachomatis en muestras de cuello uterino

Inmunoensayos
Para detectar anticuerpos Metodologa ELISA Utilizan antgenos unidos a un elemento slido (esfera de poliestireno, pocillo de microplaca al que se le aade suero del paciente.

Si el suero tiene anticuerpos especficos se unen a os antgenos.

La reaccin se revela mediante un segundo anticuerpo conjugado con: Enzima Istopo radioactivo (I125) Sustancia fluorescente Enzimoinmunoensayo (EIA) Radioinmunoensayo (RIA) Fluoroinmunoanlisis (FIA)

Se lee la seal con un espectrofotmetro (EIA), contador de centelleo (RIA) o un fluormetro (FIA)

Inmunotransferencias
Inmunobloting o Western Blot Separacin de antgeno proteico por electroforesis en gel de poliacrilamida Transferencia del antgeno separado a una membrana de nitrocelulosa Se incuba la membrana con el suero del paciente y se detectan los anticuerpos mediante una anti-inmunoglobulina humana conjugada con una enzima. Se forman bandas coloreadas donde se ha producido la reaccin antgeno anticuerpo. Se puede usar tanto para detectar antigenos como anticuerpos. Se emplea para confirmar resultados positivos de pruebas de tamizaje por EIA de anticuerpos frente al virus del SIDA