Electroforesis de Seroproteinas

ELECTROFORESIS DE SEROPROTENAS
Mtodo p separacin de protenas sricas (protenas transport., anticuerpos, inhibs enzims, facts. de la coag., etc.) x su migracin como partculas cargadas en un campo elctrico. Usado p. seroprotenas, lipoprotenas, isoenzimas, hemoglobinas, haptoglobinas, glicoprotenas, etc.
T. Hayde Ziga Cceres
En suero hum. existen + de 125 protenas identificadas, con diversas funciones. Protenas sricas totales o las proporciones de las fracciones proteicas cambian durante 1 variedad de enfs, por lo que cuantificarlas es de valor en el diagnstico clnico.
SOPORTES:
CLASE I: Separan molculas en base a la carga molecular neta. Ej.: materiales de capa delgada: papel, acetato de celulosa, y gel de agarosa. Se obs. 5 bandas de protenas sricas. CLASE II: Ade+ de la separacin electrosttica poseen un efecto de tamizado. Tamao del poro del gel es del mismo orden que el de las protenas. Ej.: almidn, gel de poliacrilamida. Actan como trampas p las grandes molcs y las + peqs. migran sin impedim. El poder de resolucin de estos geles es mucho >. Se visualizan 25 bandas o +. T. Hayde Ziga Cceres 3
BUFFERS y pH:
NH2 | H C COO| R NH3+ | H C COO| R NH3+ | H C COOH | R
pH bsico pH cido
pH neutro
Punto isoelctrico
Las protenas son molculas anfteras, son partculas no cargadas o cargadas positiva o negativamente segn el pH del buffer.
T. Hayde Ziga Cceres 4
Conociendo el valor del pH del punto isoelctrico ( pI ) p. las susts a ser separadas, se puede elegir un buffer p. su separacin; ej.: barbital, que no ppta ni desnaturaliza las protenas y confiere una carga ( - ) a la mayora de las protenas sricas a pH 8.6. En un campo elctrico, las molculas de protena negativamente cargadas migran hacia el nodo.
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
Permite separar 5 a 6 bandas. C/fraccin electrofortica representa un conj. de protenas. til p. el diagnstico de gammopatas monoclonales, cirrosis heptica, insufic. renal, hipogammaglobulinemia, mieloma mltiple, etc.
REACTIVOS:
1. BUFFER: Tris 6.05 g Barbital Na 10.30 Barbital 2.57 Agua c.s.p. 1 Litro 0.05)
( pH 8.6;
f.i.
Usar 100 mL p. humedecer tiras y 200 mL p. la cmara. Refrigerado sirve para 4 a 6 corridas. 2. COLORANTE: Disolver 1 cps. de Rojo Ponceau S en 100 mL de c. tricloroactico al 5 % 3. LAVADO: 300 mL de c. actico 5 % (3 baos de 100 mL c/u) 4. SOLUCION DESHIDRATANTE: 100 mL. de metanol absoluto T. Hayde Ziga Cceres 7 5. SOL. CLARIFICADORA: 100 mL. de 12 % de c.
PROCEDIMIENTO:
A) B) C) D) E) F) SEPARACIN COLORACIN DECOLORACIN DESHIDRATACIN CLARIFICACIN CUANTIFICACIN: a) Scanneado en el densitmetro: b) Elucin en NaOH 0.1 N c) Disolucin en Acetona: Ac. actico glacial (1:1) Leer a 517 - 525 m vs el Bl. (disolucin de 1 porcin de la tira no coloreada).
Rangos normales de fracciones proteicas por electroforesis en acetato de celulosa Fraccin Albmina Globulinas: 1 2 % del Total 54.0 - 74.0 1.1 4.6 7.3 8.1 - 4.2 - 13.0 - 13.5 - 19.9 g/dL 3.7 - 5.7 0.1 - 0.3 0.4 - 1.0 0.5 - 1.0 0.5 - 1.5
Protenas totales: 100.0
6.5 - 8.2
Principales protenas encontradas en cada fraccin:

Albmina: Globulinas: 1: 1-antitripsina, 1-lipoprotenas, 1-glucoprotena,

Protrombina, Glob. fijadora de hormona tiroidea 2: 2-macroglobulina, Haptoglobina, Ceruloplasmina, 2-lipoprotenas, Eritropoyetina.
: :
Transferrina, -lipoprotenas, C3 y C4 componentes del complemento, Inactivador de estereasa C1, Hemopexina, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.
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ELECTROFORESIS DE SEROPROTEINAS NORMAL Y PATOLGICAS
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ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS
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Pauling e Itano en 1949: 1a identif. de 1 variante de Hb: HbS. Hb normal de un adulto en acetato de celulosa pta.: HbA: 95-98 % HbA2: < 3.5 % Anhidrasa carbnica I y II.
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Electroforesis en acetato de celulosa a pH alcalino
Principio: En tampn alcalino de tris-EDTA-borato, pH 8,4, la > parte de las Hbs. tienen una carga negativa y en un campo elctrico migran desde el punto de aplicacin catdico hacia el nodo ( + ). La electroforesis en acetato de celulosa es un mtodo semicuantitativo de screening para las Hbs A, A2, F, S, G, C, E, O y D
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Preparacin del hemolizado
Principio: La cuantificacin y diferenciacin de las Hbs requiere de sangre hemolizada. La sangre anticoag. se conc. x centrifug. y hemoliza por adicin de: agua+congelamiento+cloroformo, agua+ tolueno o solucin de saponina. Glbs bls, plaquetas, estroma y protenas plasms se eliminan x centrifug y lavado con sol. salina.
Macromtodo
Centrif. 5 mL de sangre anticoag., remover el plasma y lavar los GRs 3 v. con sol. salina fisiolg. Elim. la sol. salina sobrenad. final y registrar el volumen de GR empaquetados. Por c/mL de GR aadir 1.5 mL de agua dest., agitar, y poner congelar. Remover y dejar descong 15. Agregar 0.4 mL de cloroformo x mL de GR empaquetados. Agitar vigorosam. x 5 y centrif. x 15 a 3000 rpm. El hemolisado est en la capa superior.
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Micromtodo
Reactivo: Reactivo lisante saponina: 1. Solucin de reserva: Polvo de saponina, 1 g. + agua c.s.p. 100 ml. 2. Solucin de trabajo: 10 ml de Solucin de reserva + agua 90 ml + 2 ml de KCN al 3 %.
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Procedimiento:
Llenar 2 tubos heparinizados con sangre de puncin dactilar. Cerrar 1 extremo con plastilina y centrifugar x 5. Muestra estable x 1 sem. en nevera. Con lima realizar una muesca en c/tubo de Hcto a 1.6 cm x encima de la plastelina y romper el tubo. Vaciar la columna de GR empaquetados en un tubo de ensayo q contenga 6 gotas de Sol. de trabajo de saponina como agente hemolizante. Sacudir x 15 p. sacar la sangre del tubo y hemolizarlo.
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Procedimiento:
Separacin: Igual que para seroprotenas, usando en vez de suero el hemolizado de los GR. Buffer: Tampn Tris-EDTA-cido brico, pH 8.4:

Tris EDTA cido brico Agua c.s.p.
10.2 g; 0.6 g, 3.2 g 10 dL.
Conectar a la fuente de poder a 250 voltios por 30 minutos.

Interpretacin y comentarios:
Todas las Hbs se desplazan del pto de aplicacin hacia el nodo (+). El pto de aplicacin puede ser poco visible y al mismo nivel 1 banda tenue de anhidrasa carbnica. Segn su movilidad las variantes de la Hb pueden clasificarse en: Hbs lentas (A2, C, CHarlem, E y O) agrupadas en las proximidades del ctodo Hbs intermedias que se ubican entre la Hb C y A (S, Lepore, D, (G) y F) Hbs ms rpidas (ms andicas) que la Hb A: (KWoolwich, J, N, I, Barts y H).
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Las Hbs con idntica movilidad electrofortica pueden diferenciarse x otros mtodos. Ej.: pruebas de drepanocitemia, solubilidad, desnaturalizacin alcalina y electroforesis en agar-citrato. Tambin pueden diferenciarse por consideraciones cuantitativas.
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Hbs. Normal, Rasgo y Anemia Falciforme
04/04/2011
T. Hayde Ziga Cceres T. Hayde Ziga Cceres
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Protenas totales: 100.0

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Principales protenas encontradas en cada fraccin:

Albmina: Globulinas: 1: 1-antitripsina, 1-lipoprotenas, 1-glucoprotena,

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