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Universidade de vora

Tecnologia de Enzimas Biotecnologia

As lipases ganharam enorme interesse dos pesquisadores porque catalisam reaes em Interfaces hidrofbicas / hidroflicos geralmente com alta enantiosselectividade.
Vrios suportes de imobilizao e mtodos tm sido aplicados na imobilizao da lipase com o objectivo de :

- Aumentar a sua
estabilidade em relao a altas temperaturas

- Aumentar a sua estabilidade em relao a solventes orgnicos

A polianilina um polmero orgnico que recentemente tem chamado ateno de investigadores na rea da Biotecnologia devido:

sua boa conductividade eltrica Monmeros de baixo custo Facilidade de sntese Boa resistncia mecnica Simples dopagem qumica

Esta caractersticas fazem da polianilina um polmero bastante atraente para a construo de biossensores electroqumicos sendo que na ltima dcada, a PANI foi reconhecida como um excelente suporte para imobilizao de enzimas devido:

sua alta estabilidade qumica e fsica; grande capacidade de reteno; A boas caractersticas morfolgicas.

O objetivo deste estudo foi investigar as perspectivas do uso de polianilina obtidos por electropolimerizao como suporte para imobilizao da lipase de Cndida rugosa e verificou-se que a sntese electroqumica usando a tcnica galvanosttica proporcionava melhor controlo sobre:

a taxa de reaco; as propriedades morfolgicas do polmero obtido Para alm disso, realizada com, significativamente menor quantidade de compostos txicos, do que a sntese orgnica comum conduzindo reduo do risco de inativao da enzima durante a imobilizao.

Neste estudo, o processo de imobilizao foi optimizado devido concentrao de glutaraldedo durante a ativao e devido ao pH e concentrao de enzima durante imobilizao, de modo a promover a imobilizao covalente.

Numa fase final do estudo, a modificao qumica da lipase com 1-etil-3-(dimetilamino-propil) carbodiimida (EDAC) e de etileno diamina (EDA), foi aplicada de modo a introduzir grupos amino adicionais , promover multiponto ligao covalente da enzima, e melhorar a estabilidade da enzima imobilizada.

Lipase de C. rugosa; Glutaraldedo (a 25%); EDAC; Anilina; Alumina de polimento; Panos de Polimento; Foram utilizados outros solventes e reagentes para anlise analtica.

Sntese electroqumica de polianilina

A sntese electroqumica de PANI foi efectuada com um elctrodo de grafite realizada galvanostaticamente em densidade de corrente constante de j=2.0 mAcm-2 a partir de uma soluo aquosa de 1,0moldm-3 de HCl contendo 0,25moldm-3 de anilina. Antes da sntese o elctrodo foi polido mecanicamente com lixa fina, e de seguida, com alumina de polimento, passando tambm com os panos, sendo os resduos de alumina retirados da superfcie do elctrodo ultrassonicamente durante 5 min. Aps a sntese, o p de anilina foi lavado repetidamente com gua destilada e secou-se a 90C sob vcuo. Quando a massa insolvel de PANI foi determinada foram retirados oligmeros de acetona durante 3h.

Activao de PANI em p

Incubao de 0,5g de polianilina em p em 20 ml de glutaraldedo (GA) em soluo tampo fosfato de sdio 20 mM (pH=7,0) durante 1h a 25C em agitao. Aps a incubao, o suporte activado de polianilina foi filtrado e lavado, a fim de eluir o GA.

Imobilizao da lipase em p de PANI

O suporte activo foi transferido para dentro de um balo com 40mL de soluo de lipase C. rugosa em 10mL de tampo fosfato de sdio durante 16h a 25C em agitao. A concentrao de lipase foi variada entre 1 e 6 mg/mL.

Modificao qumica da lipase

Aminao da lipase suspensa foi realizada utilizando uma soluo de 1M de EDA com 10-2 ou 10-3M de EDAC a pH 4,75. Passsados 90 minutos, agitou-se cuidadosamente a 25C. As preparaes foram filtradas e incubadas durante 4h com uma soluo de hidroxilamina a 0,1M de ph 7.

Ensaio de protenas

A concentrao de protena foi calculada atravs da espectrofotometria em = 595 nm

Actividade

Actividade da lipase foi determinada pelo mtodo baseado na medio dos efeitos da hidrlise de pnitrofenil palmitato (nNPP). A absorvncia foi medida a 410nm contra um branco. A curva padro foi preparada usando p-nitrofenol.

POLIANILINA SINTETIZADA ELECTROQUIMICAMENTE COMO SUPORTE DE IMOBILIZAO DA LIPASE

Concluda

a sntese electroqumica, a polianilina foi mecanicamente separada do elctrodo de grafite e foi analisada, microscopicamente, quanto ao seu tamanho e sua morfologia.

As microfotografias obtidas mostram que a sntese electroqumica de PANI leva formao de partculas de forma e tamanho varivel.

de reparar que as particulas de menores dimenses so elas, maioritariamente, em forma de basto. Relativamente s partculas maiores, so irregulares com um dimetro de cerca de 200m. Em grandes aglomerados, so visveis poros com uma dimenso de cerca de 1m (b) Dentro desses poros, a lipase tambm pode ser imobilizada, visto que as dimenses da lipase de C. rugosa serem aproximadamente 7nm x 5nm x 7nm.

Partculas de PANI foram modificadas anteriormente para permitir a imobilizao, utilizando GA.
A baixa [resduos de GA], podem levar insuficiente imobilizao da enzima , enquanto que , inversamente, de alta concentrao pode levar a indesejveis cross-linking da enzima e distoro da conformao cataltica Como tal, a concentrao da enzima GA foi optimizada em relao carga de enzima e actividade hidroltica de lipase imobilizada obtidas.

A imobilizao foi realizada com 6mg/ml na mistura de imobilizao, sendo que todos os ensaios foram realizados em triplicado.
Os resultados obtidos mostram que a variao de concentrao de GA varia entre 1 e 5 %, influenciando insignificantemente a concentrao de lipase imobilizada em suporte, existindo, apenas, entre 88,3 e 93.7mg/g de suporte seco. Por outro lado o efeito sobre a actividade da lipase imobilizada foi muito significativo, tendo sido atingida a maior actividade com uma concentrao de GA de 2%

A activao qumica de glutaraldedo no completamente explicativa, no entanto, a activao de GA tem sido aplicada com sucesso h muito tempo e com sucesso.

O tempo de ativao aplicada neste estudo foi adequada para a activao suave, levando formao de uma monocamada de GA.

O efeito quase insignificante da concentrao GA na concentrao de enzima imobilizada, indica que a concentrao de lipase aplicada foi altamente suficiente para alcanar uma saturao, no intervalo de concentrao de GA observada.
Foi, ento, possvel verificar que a actividade especfica atingiu valores mais elevados (98 IU/mg) quando a imobilizao foi realizada com 4mg/ml de preparao enzimtica em soluo de imobilizao.

Os resultados obtidos relativos carga enzimtica (quase 100mg/g) indicam que o apoio da PANI sintetizada eletroquimicamente tem elevada capacidade de ligao

No entanto , parece que a ligao permite a reteno de conformao cataltica da lipase, apenas na gama limitada de concentrao enzimtica.

plausvel que, quando a imobilizao realizada a baixas concentraes de lipase, a ligao pode ocorrer com reteno de conformao cataltica da enzima, e em posies na superfcie de suporte que permite o fcil acesso de apoio ao centro activo da enzima.
Em contraste, com maior concentrao de enzima oferecido em fase tardia do processo de imobilizao da lipase de ligao, provavelmente ocorrer em regies menos favorveis de apoio, talvez at mesmo em grandes poros de aglomerados de PANI, podendo dificultar a difuso do substrato durante as reaces.

Com

fim a promover a imobilizao covalente e aumentar a estabilidade da lipase imobilizada, foi feito um enriquecimento da superfcie enzimtica com grupos amino, atravs de aminao qumica de grupos carboxlicos com cadeias laterais de asprtico e glutmico.

Foi

visto que a aminao qumica com a EDA, depois da activao com EDAC, tem sido aplicada com sucesso em vrias lipases industrialmente importantes. A sua adsoro em suporte hidrofbico, tem como objectivo proteger alteraes qumicas indesejveis na vizinhana do centro activo da lipase e na perda de actividade.

aminao foi realizada com diferentes concentraes de EDAC (0,01 M ou 0,001 M), para assegurar a aminao parcial ou completa, respectivamente.
que a actividade da lipase no variava muito, sendo desnecessrio o processo de adsoro de lipase, simplificando, assim, o procedimento da imobilizao.

Verificou-se

Ambas

as lipases modificadas e nomodificadas foram imobilizadas em pH=7 ou pH=10


imobilizao a pH 10 foi testada porque o pK de grupos -amino da lisina de cerca de 10.

A maior actividade (7,1 UI/g) foi alcanada, utilizando lipase no modificada na imobilizao realizada a pH 7
A maior actividade especfica (93,7 UI/g) foi medida para o derivado obtido com lipase modificada, com 0.01M EDAC imobilizada a pH 10

O efeito de aminao, aplicada concentrao EDAC, e imobilizao de pH em: (a) a actividade global da lipase imobilizada, e (b) actividade especfica imobilizada lipase. Imobilizao pH foi de 7 (barras cinza escuro) ou 10 (barras cinza claro)

Observou-se,

ento, um aumento da actividade de imobilizao a pH 10 podendo esta, ser devido orientao mais favorvel da enzima durante o processo de imobilizao resultante com a enzima imobilizada com centro activo bem exposto e, consequentemente, maior atividade.

O ensaio da estabilidade trmica foi realizado a 60C e a pH=7,0. Para facilitar a comparao das estabilidades foram determinadas semividas de diferentes derivados e os resultados obtidos esto apresentados na tabela.
Lipase
Imobilizado a pH=7

[EDAC] em aminao (M)


0.001 0.01 0.001 0.01 0.001 0.01

T1/2 (h)
5.3 0.8 5.7 0.4 5.9 0.5 6.9 0.7 13.1 1.1 15.9 0.9 1.2 0.4 0.9 0.4 0.8 0.3

Imobilizado a pH=10

Lpase livre

Tab. 1 Semi-vidas de diferentes preparaes de lipase C. rugosa determinao em estabilidade a 60C

O pH de imobilizao e modificao qumica de lpase exibiram forte influncia sobre a estabilidade de lpase imobilizada. A imobilizao a pH=10 resultou de derivados com maior estabilidade. Para a lpase no imobilizada a pH=10 levou a um aumento de semi-vida de t1/2=5.3h(pH=7,0) para t1/2=6.9h, enquanto que para a lpase modificada com 0,01M EDAC o aumento foi ainda maior passando de t1/2=5.9h para t1/2=15.9h. A aminao da lpase tambm nos mostrou um efeito positivo sobre a estabilidade dos derivados imobilizados, particularmente em imobilizaes efectuadas a pH=10. Os derivados obtidos utilizando lpase aminada exibiu cerca de duas vezes maiores semi-vidas do que os derivados obtidos a partir de lpase no modificada. Como consequncia, parece que maiores nmeros de ligaes covalentes com grupos carbonil de PANI activa foram formados levanto a um significativo aumento da estabilizao da lpase imobilizada.

Uma vantagem importante das enzimas imobilizadas a possibilidade da utilizao repetida atravs de uma srie de ciclos, portanto a possibilidade de recuperar lipase imobilizada em PANI foi analisada. O derivado imobilizado foi separado usando centrifugao a baixa velocidade. A estratgia de reutilizao foi efectuada por comparao de dois derivados: um com lipase no modificada a pH=7 e outro com lipase aminada a pH=10.

Figura Resultados de reutilizao de lipase

Estes resultados indicam que a abordagem com base no aumento de numero dos grupos amino reactivos na superficie da lipase e imobilizao em condies bsicas provoca um aumento significativo de reutilizao de enzima imobilizado. Ou seja, foi obtido 91% da actividade inicial aps 15 ciclos de reaco, enquanto que na enzima no modificada foram obtidos apenas 73% da actividade inicial.

Os resultados demonstram, claramente, que a polianilina sintetizada electroquimicamente pode ser aplicada como suporte de imobilizao depois da ativao com GA, j que, aproximadamente, 100 mg de lipase de C. rugosa foram imobilizados por 1 grama de p de PANI com atividades especficas a atingir os 98 IU/mg.
As dimenses e a morfologia da polianilina em p obtida permitem uma simples separao do derivado imobilizado, a partir da mistura de reaco atravs de uma centrifugao a baixa velocidade .

A estabilidade das lipases imobilizadas obtidas foi significativamente melhorada utilizando abordagem que combina a modificao qumica da enzima antes da imobilizao e otimizao de imobilizao de pH.

O enriquecimento de superfcie da lipase com o grupo amino e realizando imobilizao a um pH 10 provou ser uma boa estratgia para aumentar estabilidade trmica da enzima imobilizada.

Esta estratgia permitiu, tambm, um importante aumento na estabilidade da operao, resultando lipase imobilizada que retm 91% da actividade inicial depois de 15 ciclos de reaco.

Uma maior estabilidade operacional foi observada com a enzima imobilizada no elctrodo revestido com polianilina, o que implica a combinao aplicada de preparao de suporte (pr-modificao de enzima), e as condies de imobilizao leva a uma enzima imobilizada altamente estvel, com boas perspectivas na construo de biossensores.