Introduo ao PCR

Reao da Polimerase em Cadeia

Outubro de 1985 (idia em 1983) American Society of Human Genetics criado por Kary B. Mullis
http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/

Caractersticas do PCR
Amplificao de Seqncias Processo Cclico
15 a 40 ciclos realizado por mudana de temperatura

Produo de DNA por PCR

Produo de 2 a 4 mg DNA em 1-3 hs especfico = amplifica sequncia-alvo na presena de DNA genmico sensvel = detecta at apenas 1 sequncia de molde flexvel = muitas variaes da tcnica bsica de PCR

Requerimentos Bsicos do PCR

1. Molde - DNA ou RNA 2. DNA polimerase 3. dNTPs 4. Iniciadores de Oligonucleotdeos (Primers)

Funo dos Iniciadores

Primers

fornecer grupo 3 OH para iniciao de sntese de DNA definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado estabelecer especificidade

Funo dos Primers

Oligos Iniciadores

Primers

sintetizados quimicamente tipicamente entre 15 a 25 bases define limites de alvo a amplificar

prvio conhecimento da sequncia alvo traduo reversa de uma sequncia de PTN primer de seqncias aleatrias

Ciclos de Temperatura no PCR

Anelamento do Primer Tm Desnaturao 94oC Extenso do Primer 72oC

Desnaturao do DNA 94 a 100oC

desnaturar DNA alvo desnaturar produtos de ciclos prvios 4 a 10 min de desnaturao inicial durao de 30 s a 1 min

Anelamento do Primer 40 a 70oC

temperatura de hibridizao otimizao da temperatura para cada par de primer
composio = %G+C
Tm = 81.5 + 16.6(log10([M Na+])) + 0.41*(%GC) - 600/length

determina especificidade do produto amplificado

tipicamente 30 s a 2 min

Anelamento do Primer
%G+C
Tm = 81,5o + 16,6 * (log10([M Na+])) + 0,41*(%GC) 600/comprimento
[Na] em concentrao Molar {PCR usa-se KCl} %GC em percentual comprimento em bases
Primer3 - 600/length GCG - 674/length

formamida: subtrair 65*(% formamida)

Primers > 10 bases em 0,05 M sal (PCR) Tm = 59,9 + 0.41*(%GC) - 675/comprimento

http://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/netprlaunch.html

Extenso do Primer 72oC

Taq polimerase
faixa de atividade: 20oC a 85oC atividade varia 100x nessa faixa

Tempo de extenso varia de acordo com tamanho do produto desejado

Exponencialidade do PCR
Caso ideal:
N = N o 2n
N = nmero de molculas amplificadas No = nmero inicial de molculas n = nmero de ciclos de amplificao

Amplificao Geomtrica
Ciclo 1 5 10 15 20 25 30 35 40 Nmero Fita Duplas produzidas 0 8 256 8.192 262.144 8.388.608 268.435.456 8.589.934.589 274.877.906.800

PCR

Cintica do PCR
Fase inicial (screening)
Primers procuram o DNA molde com sequncias complementares (como sondas) Primers em considervel excesso. acmulo exponencial do fragmento de DNA vrias cpias das sequncias alvos amplificao j sub-tima

Fase exponencial

Fase tardia ou plateau

Efeito Plateau
Desvio do ideal terico
reassociao do produto compete com anelamento do primer polimerase torna-se limitante perda de atividade acmulo de inibidores da polimerase (pirofosfato) Limitao de outros componentes Competio entre produtos Pareamento produto x molde amplificao no especfica

DNA molde
nmero de cpias
tipicamente 105 a 106 molculas-alvo
Quantidade de DNA = equivalente a 3 x 105 cpias FONTE Genoma Haplide (pb) Quantidade Humano 3 x 109 1 mg Levedura 2 x 107 10 ng E.coli 4 x 106 1 ng plasmdeo 3 x 103 1 pg

DNA molde
Nmero de cpias DNA genmico: 50 a 250 ng
1 mg de DNA genmico humano = 3 X 105 molculas de um gene nico

O mesmo nmero de molculas est presente em:

10 ng de DNA genmico de levedura 1 ng de DNA genmico de E. coli 1-2 pg de plasmdeo 2 pg de bacteriofago l

Taq DNA Polimerase

Protena de 94 kDa Temperatura tima: 75 a 80oC Termoestabilidade limitada Ausncia de funo de edio
sem exonuclease 3 para 5 Concentrao de enzima = 1 a 2,5 U / 100 mL

Efeito da Temperatura na Taxa de Sntese de DNA

Temperatura
22oC 37oC 55oC 70oC 75oC

Taxa de Sntese
(nucleotdeos /seg)

0,25 1,5 24 > 60 > 150

Estabilidade da Taq sob Altas Temperaturas

Temperatura 92,5oC 95,0oC 97,5oC T 1/2 (minuto) 130 40 5

Frequncia de Erro de DNA Polimerases Termoestveis

Enzima Taxa de Mutao
por 10-6 inseres de base

Taq Vent (NEB)

300 57

Fatores Promotores da Fidelidade da Taq e Especificidade dos Primers

baixar a concentrao de dNTPs (menos 200 mM) concentrao de Mg++ - inversa/

[Magnsio]
Concentrao de Mg2+ afeta:
anelamento dos primers temperatura de desnaturao do DNA molde e dos produtos amplificados

Especifidade da reao Formao de dmeros de primers Atividade e fidelidade da enzima Usualmente inicia com 1,5 mM

Consideraes na Seleo de Primers

Especificidade: primer deve formar duplex estvel no stio alvo especfico Primer no forma duplex estvel com si prprio ou com o outro primer Primer no possui stios falsos no DNA alvo

Estabilidade dos Primers

Comprimento - nmero de bases Relao GC/AT Temperatura de desnaturao Tm

anlises do vizinho mais prximo energia livre de formao de duplex

Tm x GC%

Critrios para desenho de primers

Composio de bases:
primer
GC% = 40 a 60% distribuio homognea ao longo do
18 a 25 bases do primer complementar ao molde Ambos primers = mesmo comprimento (at 3 bases)

Comprimento:

Critrios para desenho de primers Seqncias repetidas ou autocomplementares:

Complementaridade entre par de primers:
Sem repeties invertidas no primer ou seqncias auto-complementares com + 3 bases seguida

3 de primer no pode ligar a qualquer ponto do outro primer Primers presentes em alta concentrao e formao de hbridos com amplificao de dmeros de primers

- Temperatura de fuso:
O Tm calculado dos dois membros do par de primers no deve diferir em mais que 5oC O Tm do produto amplificado no deve diferir dos valores de Tm dos primersem mais que 10oC.

Temperatura de Separao de Duplexes de DNA

Tm = 81,5 + 16,6 log [Na+] + 0,41 (%G + %C) 0,65 (% formamida) - 675/comprimento % erro de pareamento

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Especificidade dos Primers

Teoricamente 15 bases estabelecem especificidade
1/4
15

= 1,1 x 10

-9

Famlias de genes relacionados Duplicaes assume toda sequncia do primer envolvida seleo de stio-alvo

Problemas comuns no Desenho de Primers

Auto-complementariedade Complementariedade entre primers Establidade trmica excessiva

Auto Complementariedade
Formao de ala
GAACTACCACTGAAGATACTTCAGT

HOTGACTTC

ACTGAA

Tm = 71oC

Auto Complementariedade
Formao de ala sem problema
GAACTACCTACGAAGATACTTCAGTOH Tm = 24oC CTTC GAAG

Complementariedade entre

Primers

Formao de primer dimer

5 GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH 5 CTTCAGGTCAAGAACTTCCTTCAGTOH

GAACTACCATAGACACACTGAAGGOH

OHTGACTTCCTCAAGAACTGGACTTC

Excesso de Estabilidade Trmica em 3OH

TTTACTTAGTCGGACGCGGC OH

CGCGGC OH -------------GCGCCG-------------------Extremidade 3 crucial = preferir 3 como G ou C. No recomendvel que seja ...NNGG ou ...NNCC -> gerar dmeros de primers

A extremidade 5 no precisa ser complementar seqncia alvo = permite adicionar seqncias com propsitos especficos na extremidade 5

- stio para enzima de restrio, mais 3 a 4 bases adicionais

- promotores para transcrio in vitro - promotores de seqncias consenso para inico de traduo para transcrio e traduo in vitro

Para o clculo do Tm considera-se apenas a regio complementar seqncia alvo.

Primers com stios para enzimas de restrio:

Estabilidade Interna
Melhores primers possuem terminal 5 estvel e terminal 3 instvel
reduz pareamento falso

Baixa estabilidade 3 previne a formao de DNA duplexes que podem iniciar a sntese de DNA
terminal 5 deve parear para formar duplex estvel

Mal-pareamento pr-PCR
Causas:
DNA fita simples complexo na amostra molde mistura de reao completa incubada a temperatura com atividade da Taq

Soluo - Hot Start

Preveno de Mis-priming
PCR Convencional
Mix de reao completo 20 a 25 oC Transferir para termociclador Ciclos Produto amplificado

PCR Hot Start

Mix de reao completo 20 a 25 oC Transferir para termociclador desnaturao 100 oC manter a 80 oC Adicionar Taq polimerase Ciclos Produto amplificado

Enzimas para Hot-Start

AmpliTaq Gold Platinum Taq Polymerase
enzima recombinante forma inativada - ativao 10 min 94oC ligao com inibidor termolbil contendo anticorpo monoclonal

http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi http://genomics.biotech.ufl.edu/~wgf/primer/index.htm

Parmetros dos ciclos:

1. Temperatura e Tempo de desnaturao
Falta de desnaturao da template uma causa comum de falha na PCR Tipicamente 94oC por 30 s Tempo de desnaturao muito longo reduz a meia vida da enzima

Parmetros dos ciclos:

2. Temperatura e Tempo de anelamento
Temperatura de anelamento = 5oC abaixo do Tm real dos primers Tempo de anelamento = 15 a 30 s Tempo de extenso funo tamanho do AMPLICON
1 minuto suficiente 1,2 kb Longo reduz a meia vida da enzima

A Tm do produto amplificado no deve exceder ~85oC. Temperatura de desnaturao em PCR definida como a temperatura na qual h separao irreversvel das fitas de uma populao homognea de molculas. A temperatura de separao irreversvel das fitas vrios graus acima do Tm (tipicamente, 92oC para DNA com 50% de G+C).

DNA Polimerases
Sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um primer pela incorporao de NTPs na direo 5 -> 3 tendo como orientao a informao contida na fita molde (template).

DNA Polimerases
As DNA polimerases normalmente tm tambm atividade exonuclease 3 -> 5 = atividade proof reading 5 -> 3 = atividade corretiva

necessidade de remoo de um segmento de DNA que est a frente da enzima

DNA Polimerases Termoestveis

Thermos aquaticus (Taq polymerase) Thermus thermophilus (rthpol) a = similar subunidade da DNA pol-III de E. coli.
rTth pol atividade de transcriptase reversa na presena de Mn2+
> adio > [Mg2+] e de [enzima]. A base a mais adicionada quase sempre A 1 descoberta e + usada Sntese 5-> 3 / Exonuclease 5-> 3

DNA polimerases adicionam base a mais na 3

DNA Polimerases Termoestveis

Thermos aquaticus (Taq polymerase)
Taxa de incorporao de bases erradas pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo das concentraes de Mg2+ e dNTPs A incorporao de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interao da enzima com o DNA, favorecendo a interrupo da polimerizao. Baixa temperatura de extenso e elevada concentrao de dNTPs favorecem a extenso de primers com pareamento imperfeito e a extenso aps mismatch.

DNA Polimerases Termoestveis

Pyrococcus furiosus (Pfu) - com 2
subunidades codificadas por 2 genes de nico operon Forte atividade exonuclease 3->5 (atividade proof reading)

Enzimas com atividade proof reading no adicionam A na extremidade 3OH, independentemente do molde

DNA Polimerases Termoestveis

Polimerases com funo corretiva Pyrococcus furiosus (Pfu) Thermoccocus litoralis (Tli) Promega Vent DNA polymerase = Tli recombinante New England Biolabs
Atividade exonuclesica 3-> 5 Mais termoestveis que a Taq Meia vida de 6,7 h a 95oC) Sintetizam fragmentos de at 13 kpb.

Variaes de Taq polymerase

AmpliTaq: Taq polimerase produzida em E. coli. Reprodutibilidade maior que enzima nativa [Applied Biosystems] AmpliTaq Gold: forma modificada da AmpliTaq fornecida em forma inativa. Requer aquecimento a 94-95 oC por 10 min para ser ativada Stoffel fragment: forma amputada da Taq sem 289 amino cidos terminal N, sem atividade exonuclease 5 --> 3. Cerca de 2 vezes mais termoestvel que a Taq [Applied Biosystems]

Variaes de Taq polymerase

Taq 2000 : Taq recombinate altamente purificada [Stratagene]

AdvanTaq: sem amino cidos N-terminais com

maior termorresistncia, melhor atividade em faixa ampla de [Mg] e maior afinidade pelo molde uso concentrao de DNA alvo muita baixa [Clontech]
capacidade de sntese de DNA (3 vezes mais produto que a Taq) [Hybaid]

AGSGold DNA polymerase: maior

PCR de longa distncia

Mistura de enzimas = melhor que uma nica enzima para amplificar fragmentos longos KlenTaq / Pfu (ex.: 160:1 a 640:1) Taq / Pfu
Existem vrias misturas disponveis comercialmente
Elongase (Invitrogen) Expand DNA Polymerase (Boehringer) Advantage (Clontech)

Modelo de funcionamento da mistura de enzimas

Elongase (Invitrogen)

Taq/Pfu