Introduction

La microbiologie est la science qui tudie les organismes vivants microscopiques appels communment microbes, soit: Certains eucaryotes Champignons et certaines algues (vgtaux). Protozoaires (tres unicellulaires animaux). Tous les procaryotes Cyanophyces ou algues bleues (vgtaux). Bactries. Les Virus

La microscopie
La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures biologiques. Le principe est dans tous les cas le mme : une onde est envoye sur la prparation ou mise par la prparation. Aujourd'hui la microscopie est divise en deux grands groupes, diffrents par la nature de la particule lmentaire implique : Le microscope optique Le microscope lectronique

1. La microscopie optique
Le premier microscope fut sans doute fabriqu par Hans et Zacharias Janssen, deux fabricants de lentilles nerlandais, en 1590, mais le modle final fut invent par Antoine van Leeuwenhk en 1664, puis fut amlior par Christian Huygens. La microscopie optique regroupe: Le microscope fond clair Le microscope fond noir Le microscope contraste de phase Le Microscope fluorescence

1-1. La microscopie fond clair

Utilise des les rayons lumineux. Permet le grossissement de 1500-2000 fois. paisseur de coupe ( 1-5 m). Observation vitale et colore.

Microscope fond clair

Bactrie

Protozoaire

1-2. La microscopie en contraste de phase

Cette technique permet d'observer les cellules sans prparation ni coloration dans leur milieu d'origine. Le principe est bas sur le fait que les structures biologiques sont transparentes (nabsorbe pas la lumire transmise). Ncessite un clairage trs prcis dite clairage de Koehler.

A lobservation, on voit une image en noir et blanc o les diffrentes structures apparaissent bordes de blanc dun ct et de noir de lautre.

Le microscope contraste de phase

Culture cellulaire

1-3. La microscopie fond noir

Utilise les rayons lumineux dans un fond noir. Les zones de la prparation qui diffusent la lumire apparaissent lumineuses ( claires ) sur ce fond noir.

Utilis pour les lments trop transparents.

Les lments observs apparaissent trs brillants ( les flagelles, les fibres ). N'est pas utilis pour l'observation d'objets colors.

Bulles d'air dans l'eau

Treponema pallidum

Le microscope fond noir

Cryptococcus neoformans

1-4. La Microscopie fluorescence

Cette technique est utilises pour certaines molcules qui mettent de la lumire quand on les claire avec une lumire de longueur d'onde suprieure.

On claire l'chantillon avec une lumire ultraviolette, violette ou bleue. Consiste utiliser une coloration fluorescente. Deux colorants trs utiliss sont : la rhodamine (met une lumire rouge) et la fluorescine (lumire verte).

Culture cellulaire

Le microscope fluorescence

Legionella pneumophila

2. La microscopie lectronique
Il existe deux variantes de la microscopie lectronique : La microscopie transmission
La microscopie balayage

2-1. La microscopie lectronique transmission

Utilise comme rayonnement des lectrons. Observation sous ultravide. Permet le grossissement de 75000 5000000 fois. Les chantillons sont sous forme de lames extrmement fines ( 50 nanomtre ).

L'image obtenue peut tre vue sur un cran.

L'chantillon biologique apparat plus clair que ce qui l'entoure, d'o le nom de coloration ngative. L'chantillon apparat blanc sur un fond sombre.

Le microscope lectronique transmission

Bactriophage

2-2. La Microscopie lectronique balayage

Utilise des lectrons.

Observation sous ultravide.

Permet le grossissement de 75000 5000000 fois.

Fournis des images en 3D.

Permet lobservation de 300 600 A.

des

coupes

dune

paisseur

Le microscope lectronique
balayage

Bifidobacterium adolescentis

Dfinition
La strilisation est l'opration qui consiste liminer les micro-organismes d'un objet, et de manire durable. En microbiologie, le but de la strilisation est: D'une part de matriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'tude. D'autre part d'viter la contamination du milieu extrieur et des personnes. Le choix dune mthode de strilisation est en fonction de: La nature de la substance ou lobjet striliser. Sa pollution prsume. Lquipement disponible au laboratoire.

La strilisation peut tre ralise par:

1.

2.

Des procds physiques: Strilisation par la chaleur Chaleur sche Chaleur humide Pasteurisation Tyndallisation Strilisation par filtration Strilisation par radiations Des procds chimiques: Antiseptiques Dsinfectants Antibiotiques

I. La chaleur
1. Chaleur sche Bec Bunsen (chauffage direct): Cre un globe virtuel strile de 10 cm de rayon de la flamme. A utiliser pour les objets en verre ( pipettes, baguettes de verre...), pour certains objets en mtal (anse , pince). Fours Pasteur, Poupinel ( strilisateurs air chaud ): C'est un four classique utilis pour la verrerie, porcelaine et instruments mtalliques. Les spores et germes sont dtruits en chaleur sche, par un chauffage de : 4 heures 140 C ; 2 heures 30 160C ; 30 min 180C.

Bec bunsen

Four de Pasteur

2. Chaleur humide
2-1. Autoclavage: Cette technique consiste faire bouillir de l'eau dans une enceinte close pour augmenter la pression et donc dpasser les 100C dbullition. Ceci est ralis 121C pendant 15 minutes au minimum. A utiliser pour les milieux de culture, matriel en caoutchouc, la verrerie 2-2. Les bain-marie ou bain- thermo stats ( bullition ): Un chauffage de 30 minutes 100C par bullition ou un maintien dans la vapeur d'eau bouillante suffit dtruire toutes les formes vgtatives. A utiliser pour la strilisation des produits liquides dlicats : milieux albumineux, lait, glatine, solutions concentres de glucides, ...

Autoclave

Bain marin

2-3. Pasteurisation: Conservation des produits naturels pendant un temps limit, ne dtruit que les formes vgtatives mais pas les spores. Le liquide est port rapidement 90C pendant 30s, par exemple,puis on le refroidit brusquement 10C. Conservation des produits alimentaires.
2-4. Tyndallisation: La tyndallisation est une srie de chauffages brefs des tempratures de 70C intervalles rguliers (3 chauffages d'une heure, 24 h entre 2 chauffages), ceci afin de laisser aux formes rsistantes la possibilit de germer pour les tuer au chauffage suivant. Utilisation trs limite aux substances thermolabiles non filtrables (mulsion de jaune d'oeuf, vaccins), prparation de milieux base de srum ou de jaune d'oeuf.

2. Strilisation par filtration

La filtration consiste faire passer le liquide striliser travers une paroi poreuse ou une membrane qui retient les bactries. Il existe plusieurs types de filtration: Les bougies de type Chamberland: tubes fond arrondi dont les parois sont poreuses, en porcelaine. la dimension de ces pores varie de quelques m au 1/10me de m. Disques: disques en verre fritt de porosit de 150 1 m. Membranes: membranes plastiques minces comportant des millions de pores par cm2 dont la taille, trs uniforme, varie de 8 0.01 m. Striliser des liquides altrables par la chaleur: srums, solutions hydrolysables, solutions glucidiques, vitamines

Diffrents filtres

3. Strilisation par radiations

C'est la lumire U.V qui est la plus souvent utilise ( lampes germicides ou strilampes ). Strilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux ou des hottes, servant aux manipulations en atmosphre strile. Utilisation en virologie, cultures cellulaires, prparation et conditionnement des produits pharmaceutiques, ensemencements bactriens, prparation de milieux. Les rayons X ou y sont utiliss pour la conservation de certains produits alimentaires.

3-1. Antiseptiques: Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est instantanne. ex: teinture d'iode, permanganate de potassium, eau oxygne ... Utilisation locale chez les tres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses. 3-2. Dsinfectants: Empche les contaminations humaines et animales. Vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'thylne ) Liquides ( phnols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel ) Solide ( chaux vive ) Utiliser pour tous les milieux extrieurs l'Homme: eau, air, sol ( objets inanims, dsinfection du matriel plastique utilis en microbiologie ) 3-3. Antibiotiques: Les antibiotiques bactriostatiques: stoppent la multiplication des bactries sans les dtruire. Les antibiotiques bactricides: qui tuent les bactries Utilisation in vivo.

Pipette gradues

Pipette jauges

Pipette pasteur

Ballon

Becher

Erlenmeyer

prouvette

Verre pied

Fiole

Cristalloir

Flacon

Boire de ptri

Entonnoir

Dessiccateur

Tube essai