Calzadaz Ramrez Liliana

Introduccin

Celulosa

Hemicelulosa xilano

*Microorganismos
* Plantas

Enorme potencial para la produccin de biocombustibles

Tracto digestivo de animales

Celulosa y hemicelulosa

Celulasas
endoglucanasas

Xilano
Endo-1,4-B- xilanasa

exoglucanasas

B - xilosidasa
B glucosidasas

1 gramo contiene ms de 10 billones de M.O., menos del 1% son cultivables

Fuente de nuevos biocatalizadores y biomolculas de importancia industrial

suelo

Hbitat ms diverso en la Tierra

Clulasas: - Cellvibrio mixtus - Clostridium thermocellum

Objetivo

Metagenmica

3 diferentes muestras de pastizales

Identificacin de: 1, celulasa 2, xilanasas

Materiales y mtodos

Abril y Mayo 2008

Aislaron los genes codificantes de enzimas (hemi)celulolticas
German Biodiversity Exploratories SchorfheideChorin (SEG9) y Schwbische Alb (AEG3 y AEG6)

Muestras de suelo

10g de suelo por muestra

MoBio Power Max Soil DNA extraction kit

CopyControl Fosmid library production kit

Bibliotecas de insertos grandes en fsmidos

AEG3 y AEG6 ; SEG9

4600 bibliotecas con clonas del suelo

Dispuestos y almacenados en placas de microtitulacin de 96 pocillos

Clonas restantes fueron recogidas y almacenadas como clone pools a 80C

Condiciones de crecimiento y proyeccin de actividad enzimtica

E. Coli en medio LB a 37 C

Actividad enzimtica en placas con LB y formas insolubles coloreadas

- Hidroxietilcelulasa (rojo) - Xilano (verde)

Clonas con actividad

Halos despus de la incubacin de 1 a 14 das a 37C

Subclonacin y anlisis de secuencias

Fsmidos de clonas positivas

Sonificacin

Electroforsis

Se ligaron con el vector pCR-XLTOPO para transformar E. Coli TOP10

Cortaron y extrajeron con pEQ gold gel extraction kit

Fragmentos de 2 a 6kbp

Cepas recombinantes

Se visualizaron en cajas con indicadores

Genes de actividad celulasa y xilanasa

Se secuenciaron

Positivas: plsmidos recombinantes

Se localizaron los ORFs en los insertos

Plsmidos: - pLC01 - pLX1 -pLX2

Criterios: - Presencia de sitio de unin a ribosoma - Contenido de GC - Similitud con genes conocidos

Resultados se analizaron

Alineamiento mltiple

CLUSTAL W2

Examinado con BioEdit

Secuencias nucleotdicas de los plsmidos recombinantes

Genes de xilanasa: - xyn01 - xyn02

Celulasa - cel01

GenBank

Clonacin del gen codificante de celulasa Cel01 en el vector de expresin pET101/D

Gen cel01

Se amplific del plsmido pLC01

ATG en el sitio sinttico, permite la clonacin dentro de pET101/D Plsmido resultante pCel01

Preparacin de extractos celulares

Clulas de 500ml de cultivo

Se cosecharon

Extractos celulolticos y xilanolticos se lavaron con buffers LEW y de fosfato de sodio 50mM

El extracto se centrifug y el sobrenadante se analiz posteriormente

Se rompieron las clulas con una prensa francesa

Se resuspendieron en el mismo buffer

Purificacin de celulasa

Cromatografa de afinidad de nquel Ultrafiltracin para cambiar de buffers y purificar celulasas

Evaluacin por SDS-PAGE

Deteccin de Eptope V5 de protenas provocadas por Western Blot

Ensayos de protenas y enzimas

Cuantificacin de protenas por mtodo de Bradford

Actividad enzimtica

Incubando en glucano de cebada y CMC (2%)

2g de enzima purificada en buffer de 0.2M de Na2 HPO4 / 0.1M de cido ctrico a 40C

Se visualizan los azcares al calentar 120C por 20min

Se roci con etanol/cido sulfrico

Producto se separa en placas de silica con 1propanol/etilacetato/H2O

RESULTADOS

Construccin de bibliotecas metagenmicas de DNA

Nmero de clonas 147, 888 121, 520 95, 160

Biblioteca SEG9 AEG3 AEG6

9.42Gpb de DNA clonado de suelo

Asume un genoma procarionte de 5Mbp

Representa aproximadamente 1,900 organismos procariticos

Actividad enzimtica

fLX01 fLX02 fLC01

Positivas

Vector pCRXL-TOPO en E. Coli

Agar HEC (rojo), Xilano (verde)

Insertos pLC01 pLX01 pLX02

Se secueciaron y analizaron

Cel01

Familia 9 glicosilhidrolasa

Residuos catalticos D148, D4321 y E808

CBM9 y Cel-N-term

Actividad enzimtica :
780 11.50 U mg-1

Extracto con His6 se purific con cromatografa de afinidad a metales y ultrafiltracin

endo 1,4-b-glucan hydrolase

glucose (G1) cellobiose (G2) cellotriose (G3) cellotetraose (G4)

Conclusiones
En este estudio, la construccin y estudio de bibliotecas metagenomicas de suelo con insertos ha llevado al descubrimiento y caracterizacin de dos xilanasas y una celulasa nuevas.

La novedad de estas enzimas se deriva de la enorme diversidad gentica de microorganismos de la tierra sin cultivar.

Las enzimas recuperados tienen algunas propiedades interesantes como la alta actividad de las xilanasas en una amplia gama de temperaturas y valores de pH.

La celulasa derivada de metagenoma tiene potencial para aplicacin industrial