FUNDAMENTOS DE

ENGENHARIA
GENÉTICA
DNA recombinante (Parte II)
 Questões

 O que é a Tecnologia do DNA

recombinante?
 Como se introduz um gene estranho
dentro de uma bactéria?
 Quais as utilidades desta técnica?
 Não será perigoso?
Documento vídeo

Filme
 Rever os conhecimentos teóricos
necessários aos
estudo desta situação.
DNA: estrutura e localização
Noção de gene
Expressão da informação genética
Revisão de conceitos
Clonagem: processo pelo
qual se obtém um clone
ou um conjunto de indivíduos
geneticamente
idênticos.

Clone: grupo de células

geneticamente idênticas e
descendentes de uma só
célula inicial.
Célula Bacteriana
 Plasmídeos
Os plasmídeos são
moléculas circulares de
DNA que estão
separadas do DNA
cromossómico.
Os plasmídeos contêm
geralmente um ou dois
genes.
Os plasmídeos podem
replicar-se
independentemente do
DNA cromossómico.
Princípios Básicos.
Clonagem de Genes
Clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de ADN ocorre da
seguinte forma:
a) Gene é ligado a um vector, formando um DNA recombinante.

b) Esta molécula é introduzida numa célula hospedeira (bactéria)

onde permanece num estado epissomal (não integrado no genoma
do hospedeiro).
c) Vector tem a capacidade de se replicar autonomamente.

d) À medida que a célula hospedeira se vai dividindo, o vector

recombinante também se divide e é transmitido às células-filhas,
formando-se um clone de células iguais.
Clonagem em E. coli
utilizando plasmídeo vector
Objectivos da clonagem
 Utilização da tecnologia do
DNA recombinante
Substância obtida pela tecnologia do Aplicação
rDNA
Hormona do crescimento Disfunção hipofisária
Factor de crescimento da pele Processos de cicatrização da
pele
Interferão Cancro
Factores de coagulação VII, VIII e IX Hemofilia
Vacina para a hepatite Hepatite B
Teste da SIDA Despiste da SIDA
Superóxido dismutase Evita a extensão de danos
após enfarte do miocárdio.
Eritropoetina Anemia
Enzimas relevantes em
clonagem
 T4 DNA ligase – fundamental no DNA recombinante.
 DNase I  faz cortes aleatórios não específicos.
 DNA polimerase I  enzima bacteriana que sintetiza
DNA.
 RNA polimerase  sintetiza RNA complementar.
 Transcriptase reversa  utiliza a cadeia de RNA
como molde, requer a presença de um primer.
Sintetiza o DNA. (primer - molecule that serves as a
starting point for DNA replication)
Exemplo
Enzimas de restrição
As primeiras enzimas de restrição foram
obtidas a partir de microrganismos e têm
um papel de defesa contra a invasão de
DNA estranho (por exemplo, vírico).
Quando esta invasão acontece, as enzimas
de restrição cortam a porção de DNA de
forma específica – processo designado
restrição, não danificando a molécula
original.
Enzimas de restrição
 São as enzimas chave no processo de clonagem de genes ou
fragmentos de DNA.
 Foram obtidas a partir de microrganismos, nos quais fazem parte de um
sistema de defesa à invasão de DNA estranho (expl. Vírus).
 Cortam o DNA em locais específicos, inactivando-o mas não digerindo o
DNA endógeno que se encontra modificado em certas sequências.
 Reconhecem sequências específicas de DNA em cadeia dupla
(tipicamente sequências de 4 ou 6 nucleótidos)
Exemplo
 As mais relevantes são as que cortam o
DNA na sequência de reconhecimento.

Notas :
1. As extremidades obtidas por corte com uma Extremidades de
enzima de restrição podem voltar a unir-se, por DNA coesivas
emparelhamento de cadeias simples (cohesive ends)
complementares. A sua ligação por uma ligase
reconstitui a molécula original de DNA.
2. Pode-se modificar o tipo de extremidades.
Vectores
Características dos vectores :
a) Contêm uma origem de replicação que lhes

permitem dividirem-se no hospedeiro.

b) Têm locais onde cortam enzimas de

restrição e é possível introduzir (clonar)

fragmentos de DNA.
c) Possuem marcas de selecção (como um

gene que codifica resistência a um

antibiótico que permite seleccionar
hospedeiros que contêm o vector.
Vectores de clonagem
 Plasmídeos
 Excelentespara a clonagem de genes ou DNA
 Construção de bibliotecas de genes

 Fagos

 Existem outros vectores (para vos

atormentar no vosso futuro universitário!!!)
Identificação dos clones que apresentam o
gene de interesse

 Hibridação
 Complementarid
ade de bases
(marcadores
radioactivos ou
fluorescentes)
Biblioteca de Genes
O processo de multiplicação dos
organismos que contêm o rDNA permite
não só a produção da substância
codificada, mas também a clonagem
desse gene.
Os investigadores, conservam, cópias
desses genes, constituindo bibliotecas
genómicas ou bibliotecas de genes.