Cromatografía, técnica de análisis químico utilizada para

separar sustancias puras de mezclas complejas. Esta técnica

depende del principio de adsorción selectiva (no confundir
con absorción). La cromatografía fue descubierta por el
botánico ruso, de origen italiano, Mijaíl Tswett en 1906, pero
su uso no se generalizó hasta la década de 1930. Tswett
separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo
extracto de hojas verdes en éter de petróleo sobre una
columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de
una probeta. A medida que la disolución va filtrándose por la
columna, cada componente de la mezcla precipita a
diferente velocidad, quedando la columna marcada por
bandas horizontales de colores, denominadas
cromatogramas. Cada banda corresponde a un pigmento
diferente.
En la cromatografía en columna la fase estacionaria se
mantiene dentro de una tubo angosto y la fase móvil es
forzada a pasar a través del tubo bajo presión o por
gravedad.

La cromatografía en columna utiliza un amplio espectro de

adsorbentes sólidos, incluidas la sílice, la alúmina y la sílice
gelatinosa. También los líquidos pueden ser adsorbidos en
estos sólidos y a su vez sirven como adsorbentes (un proceso
denominado cromatografía de reparto) permitiendo al
químico elaborar columnas de diferentes propiedades para
diversas aplicaciones. En la cromatografía con líquidos de alto
rendimiento, una variante de esta técnica de uso frecuente
hoy en día, se utilizan líquidos adsorbidos en partículas muy
pequeñas y uniformes, lo cual proporciona una sensibilidad
bastante alta. Para llevar la mezcla a través de la columna se
precisa una bomba.
El principio de separación de la cromatografía es la
aplicación de un criterio de separación a las proteínas
que se desplazan a lo largo de una matriz sólida porosa.
Este criterio de separación se basa en alguna propiedad
que es diferentes entre las proteínas que se quieren
separar : peso molecular, carga eléctrica, afinidad de una
de ellas por alguna otra, etc... En función de cual sea el
criterio de separación que se aplique diferenciamos tres
tipos de cromatografía en columna
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen
una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna
así como la carga de las proteínas dependerá del pH del solvente y de su
fuerza iónica (proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones
determinadas serán retenidas en la columna las proteínas que tengan una
carga complementaria a la de la matriz del gel (las proteínas cargadas
negativamente serán retenidas por una matriz cargada positivamente),
siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se puede
variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto
isoeléctrico de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este
modo la fuerza que retiene a las proteínas en la columna.

La elución comprende el lavado de un soluto a través de una columna por

agregado del disolvente fresco. El movimiento del soluto puede ocurrir solo
en la fase movil, la velocidad promedio a la cual un soluto migra depended
de la fraccion de tiempo que gasta en esa fase; esta fraccion es pequeña
para los solutos que son retenidos energicamente por la fase estacionaria y
grade donde la retencion en la fase movil es de mayor afinidad.
La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando
unas matrices formadas por unas esferas porosas. El
volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está
determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna
dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los
poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte
entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros,
reduciéndose la concentración en la fase libre entre las
bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo puede
encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es más
elevado entre las bolas que en el interior de los poros de
éstas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el
desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular
respecto al de las de menor peso molecular. En esta
cromatografía se eluyen primero las proteínas mayores, y
en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia
en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la
misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor
La Cromatografía de Afinidad permite la separación de
mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un
determinado ligando. En este caso, las proteínas que se
retienen en la columna son aquellas que se unen
específicamente a un ligando que previamente se ha unido
covalentemente a la matriz de la columna. Después de que
las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o
eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha
quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante
el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u
otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y
la proteína.
En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel
recubierto con el ligando directamente con la solución que contiene
las proteínas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y
se procede a la elución, primero de las proteínas no unidas ('run
throught') y posteriormente de las retenidas (eluido específico).