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Esterilizao de

meios de cultivos
e equipamentos
Contaminantes podem competir por nutrientes com
o micro-organismo agente do processo;

Contaminantes podem produzir substncias
inibidoras ao processo, ou mesmo que decomponham o
produto;

Contaminantes podem produzir substncias que
venham a dificultar a etapa de separao do produto;

Contaminantes podem produzir substncias txicas
que tornem o produto inapropriado para o consumo.
Motivos para o uso da esterilizao
ou desinfeco:
Esterilizao de um meio ou ambiente a
operao destinada a eliminar todas as formas
vivas (vegetativas ou esporuladas), seja por
destruio ou remoo.
Desinfeco: a eliminao por morte ou a
inibio do crescimento de micro-organismo
contaminante atravs do emprego de uma
substncia qumica. Sua ao extremamente
seletiva sendo funo do microrganismo e das
condies ambientais.
Germicida qumico Atividade caracterstica Utilizao tpica
Compostos quaternrios de
amnio (soluo aquosa at
0,2%)
Bactrias gram-negativas, podem ser
resistentes, NA baixo.
Limpeza geral e manuteno.
Compostos fenlicos (soluo
aquosa at 5%)
Podem ser ativos at contra vrus no
lipdicos, NA baixo a intermedirio.
Desinfeco de reas
laboratoriais e de produo.
Soluo aquosa de etanol ou
isopropanol a 70%
Bactrias, fungos e amplo espectro de
vrus, NA intermedirio.
Desinfeco de materiais por
imerso na soluo ou de
equipamentos.
Soluo aquosa de cloro livre
(0,5%)
Amplo espectro, pode inativar bactrias
esporuladas, limitao de uso pela
atividade corrosiva, NA intermedirio.
Desinfeco de equipamentos,
reas laboratoriais e de
produo.
Soluo aquosa de
formaldedo (4 a 8%)
Amplo espectro, pode inativar bactrias
esporuladas, potencial carcinognico,
irritante, NA intermedirio a alto.
Desinfeco de equipamentos.
Soluo aquosa de
glutaraldedo (2%) e
surfactante
Amplo espectro, ao contra
micobactrias e bactrias esporuladas,
irritante, NA alto.
Desinfeco de equipamentos.
Formulao contendo perxido
de hidrognio (6 a 10%)
Amplo espectro, ao contra
micobactrias e bactrias esporuladas,
NA alto.
Desinfeco de equipamentos.
Utilizao de Desinfetantes
(NA: nvel de atividade)

-matam ou danificam reproduo
Agente de
desinfeco
Contaminante(s)
alvo
Tempo
requerido
Soluo de etanol
a 70%
Bactrias; maioria dos
fungos e vrus
10 min.
Soluo de
perxido de
hidrognio a 10%
Esporos de bactrias
aerbias
60 min.
Soluo de
formaldedo a 8%
e isopropanol a
70%
Esporos bacterianos 18 h.
O tempo de exposio para se atingir um determinado nvel
de destruio microbiana depender do desinfectante
escolhido e das caractersticas da populao microbiana
contaminante (tipo e nmero).
Agentes fsicos
Calor: Seco ou mido
forma mais usual industrialmente
Radiaes: raios X, , UV
mais empregadas para esterilizao de
ambientes
FILTRAO:
mais empregada para esterilizao
de ar de processo
para meios utiliza-se a microfiltrao
ESTERILIZAO DE MEIOS E EQUIPAMENTOS
Esterilizao pelo Calor
Reaes de escurecimento em Meios de
Cultivo catalisadas pela Temperatura

T
- Reao de Maillard
- Caramelizao
Em ambos os casos ocorrem degradaes dos carboidratos
(acares), conduzindo modificao na composio dos meios de
cultivo e reduo do seu valor nutricional para a clula;
R
C
O
H
+
R
1
NH
2
A REAO DE MAILLARD se d com interveno de amino-
cidos e acares redutores, enquanto a CARAMELIZAO
se d com acares redutores e no-redutores sem
participao de amino-cidos;
Nas duas transformaes, os produtos de degradao
formam compostos escuros e de alto peso molecular. No
caso da reao de Maillard, estes compostos contm
nitrognio em sua molcula e recebem o nome de
MELANOIDINAS; tornando, tanto o(s) acar(es) quanto
a(s) fonte(s) de nitrognio, NO BIODISPONVEIS;
Os fatores que afetam a reao de Maillard esto ligados
temperatura (quanto maior, maior a taxa de reao);
exposio ao calor (idem); pH (valores baixos inibem
[< -NH
2
] e altos aceleram); natureza do acar que se
relaciona com sua reatividade (poder redutor: xilose >
arabinose > hexoses > dissacardeos);
A reao de Maillard tambm chamada de
escurecimento no-enzimtico, distinto daquele
produzido por enzimas comuns em vegetais, as
peroxidases, que atuam sobre compostos fenlicos
(polifenis) dando origem a produtos de intensa cor
escura.
Polifenis Pigmentos escuros


POLIFENOL
OXIDASE
Necessidade de controle rgido da
TEMPERATURA e do TEMPO DE EXPOSIO
durante o processo de esterilizao para
preservao/manuteno da integridade
dos componentes do meio de cultivo.
Reao de Maillard Caramelizao
1. Calor seco (165
o
C/2h) - instrumental e vidraria

2. Calor mido meio de cultivo e equipamento

2.1. Presso atmosfrica (at 100
o
C)

Vapor fluente (100
o
C por 15-30 min)

Tindalizao (TML < T
e
< 100
o
C/15-30 min)
[por 3 vezes consecutivas]

Pasteurizao (TML < T
e
< 100
o
C/15-30 min)

2.2. Vapor saturado sob presso (T
e
> 100
o
C)
[usualmente 121
o
C por 20 min]

Modalidades de Esterilizao pelo Calor
TML (temperatura mnima letal): a menor temperatura na qual se
observa o incio da destruio do microrganismo contaminante, atravs da
ao do calor. funo do microrganismo e do meio ambiente.
Resistncia ao calor mido

Organismo Resistncia relativa
Escherichia coli 1
esporos bacterianos 3.000.000
esporos de bolores 2 a 10
virus/bacterifagos 1 a 5
A esterilizao de meio e equipamento pode ser
efetuada de duas maneiras:
Vapor indireto (serpentina ou jaqueta)
Vapor direto (atentar para a diluio que causar ao
meio)
Eltrico (pouco usado por ser caro)
Aquecimento
b. esterilizao de biorreator e de meio separadamente
a. esterilizao de biorreator e meio conjuntamente
gua fria
fluido refrigerante
Resfriamento

Possibilidade de esterilizao de meio continuamente
TIPOS DE TRANSFERNCIA DE CALOR NA
ESTERILIZAO DESCONTNUA
DE MEIOS DE CULTIVO
Aquecimento com
vapor direto
Aquecimento
eltrico
Aquecimento com
vapor indireto
Resfriamento
indireto
Teoria da Esterilizao pelo Calor
K
t constante
Ln N
u (min)
KN
d
dN
=
u
onde:
N: nmero de micro-organismos sobreviventes aps exposio a uma
temperatura t por um tempo u;
K: constante da taxa de destruio trmica do micro-organismo, medida
em tempo
-1
K = K (mo; meio;T)
K a forma contaminante mais resistente
}
=
}
u
u
0
0
Kd
N
dN
N
N
u K
N
N
Ln =
0
N
0
:nmero de micro-organismos no incio da exposio a
temperatura t, correspondente a u=0
Integrando a equao , temos que:

KN
d
dN
=
u
k
D o
N N e D K
N
N
Ln
303 , 2
: log
. 1 , 0 ; .
0
0
=
= = = u u
Decimal Reduction Time(D)
D = tempo para se reduzir a 10% o
nmero de MOs
Exemplo
Destruio trmica de esporos (a 105C)
Ln(N
0
):12,163
k
105
=0,0341 e D
105
=67,5 min
t(minutos) N
25 8,5.10
4

50 3,5.10
4

100 6,0.10
3

200 2,0.10
2

250 40
Dependncia de K com a temperatura
( ) RT E
e A K
/
.

=
onde:
A: constante de Arrhenius;
E: energia aparente de ativao de destruio (Kcal/mol);
R: constante dos gases perfeitos;
T: temperatura absoluta (K);
Linearizando a equao, temos que:
Equao de Arrhenius
T R
E
LnA LnK
1
|
.
|

\
|
=
T R
E
LogA LogK
1
3 , 2
|
.
|

\
|
= ou
Determinao de E
tendo as curvas de destruio trmica:
K
1

K
2

K
3

T
1

T
2

T
3

Ln N/N
0

u (min)
T
1
>T
2
>T
3

1/T
1
1/T
2
1/T
3
1/T
Ln K
K
1

K
2

K
3

-E/R
Esterilizao HTST
(High Temperature Short Time)
Energia de ativao de destruio de alguns
esporos bacterianos

microrganismo E (Kcal/mol)
Bacillus stearothermophilus 67,7
Bacillus subtilis 76,0
Clostridium botulinum 82,0
anaerbico NCA 3679 72,4
E
esporos bacterianos
= 50 85 Kcal/mol
Esterilizao de Meios de Cultivo
pelo Calor mido
Batelada (descontnua)

Contnua
Vantagens da Esterilizao Contnua:

Melhor controle de temperatura;
Facilidade de controle automtico;
Reduo do tempo ocioso;
Regularidade da demanda de vapor.
t (
o
C)
t
e

t
ML

t
amb

u
o

u
1

u
2

u
3

u (min)
N
o

N
o

N
1
< N
o
N < N
2
< N
1

N
u
Aquecimento

u
e

u
Resfriamento

Esterilizao Descontnua
Clculo de esterilizadores descontnuos
(em batelada)
}
u d K
Problema: ?????????
Resoluo:
Conhecendo-se:
Exigncias de esterilidade (N
0
/N);
Curvas de destruio (Ln N/N
0
vs u) a vrias temperaturas,
para elaborao da curva LnK vs 1/T;
Curvas de aquecimento e resfriamento.
A dificuldade de resoluo analtica
Esterilizao Contnua
Usam-se dispositivos que permitem
atingir a temperatura de esterilizao
instantaneamente, bem como resfriar o
meio rapidamente at a temperatura de
processo;
No h problema em se resolver a
integral, j que K pode ser considerado
uma constante.
X
Esterilizao Contnua
vapor
Flash
cooler
Trocador de calor
Meio contaminado pr-aquecido
Meio estril encaminhado para o(s) biorreator(es)
Seo de reteno
Meio
estril
quente
2,5-3,0 min a 145
o
C (290
o
F)
Vapor
sob
presso
Meio
contaminado
manmetro
Vlvula
redutora
de presso
manmetro
Ejetor
Fluxograma da Esterilizao Contnua de Meios de Cultivo
ESTERILIZAO DESCONTNUA versus ESTERILIZAO CONTNUA
Esterilizao Contnua
Situaes:
Caso A: Planta industrial j instalada possuindo uma
seo de utilidade que gera vapor com propriedades j
definidas.
Caso B: Seo de espera j dimensionada, no havendo
restrio na gerao de vapor com qualquer
propriedade.