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REGULAMENTAO DA NANOTOXICOLOGIA
AVALIAO COMPLETA DO RISCO DE PRODUO DE NANOPARTCULAS (Friedrichs, Schulte, 2007)
Identificao do risco Caracterizao do risco Avaliao do risco Preveno e controle o risco Avaliao das medidas de controle do
Obs:. Royal Society and the Royal Academy of Engineering of UK government, Recommend nanoparticulate materials to be treated as new substances.
Fase III 1.000 a 20.000 pacientes voluntrios para monitorar reaes adversas em uso de longa durao
Aprovao do Governo
Anos Fase IV Teste adicional ps-comercializao
0
Patente
4
Patente
10
12
14
15
solicitada concedida
Avaliao de perigo
Classificao toxicolgica
Avaliao toxicolgica
Estudos sobre mutagenicidade Mutao gnica (procariontes) Mutao cromossmica (eucariontes)
Estudos sobre carcinogenicidade Camundongo (18 meses) Rato (24 meses)
Proibio do Registro
Avaliao toxicolgica
Estudos de curto prazo Roedor (90 dias) No roedor (1 ano)
Estudos de longo prazo e carcino Camundongo (18 meses) Rato (24 meses)
NOAEL
Definies importantes
Ingesto Diria Aceitvel (IDA) - quantidade mxima que, ingerida diariamente durante toda a vida, parece no oferecer risco aprecivel sade, luz dos conhecimentos atuais
Avaliao toxicolgica
Dose 3X
NOAEL
Dose 2X
Dose X Controle
Avaliao toxicolgica
NOAEL IDA = NOAEL
Fator de incerteza
Fatores de incerteza
Azul de tripan
QUANTIFICAO DE CRESCIMENTO
http://www.ib.amwaw.edu.pl/home/dslado/video/mtt.html
Alaranjado de Acridina
Apoptosis Necrosis
AO stains DNA
Diffuse spots
NAD+
NADH
LACTATO
PIRUVATO
QUANTIFICAO APOPTOSE
Processos terminais
Nucleases: Fragmentao do DNA Morfologia (nuclear)
Processos iniciais
Fosfatidilserina Caspases
BROMETO DE ETIDIO
ALARANJADO DE ACRIDINA
DAPI
TUNEL/IODETO PROPIDIO
Clulas saudveis
Membrana polarizada Sistema de transporte ativo
DAPI
(Azul 460 nm)
Clulas vitais
Membrana polarizada Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO (Vermelho 602 nm)
Clulas intactas
Membrana despolarizada Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO (Vermelho 602 nm)
Clulas mortas
Membrana despolarizada Sem sistema de transporte ativo BROMETO DE ETIDIO IODETO PROPIDIO (Vermelho 603 nm)
normal early
Annexine-FITC
+ PI
late
Citometria de Fluxo
Espalhamento (Forma, Granulos) size Fluorescence Verde (FITC) Fluorescence Vermelho (PI)
Dados Tpicos
Side scatter Espalhamento lateral Side scatter
Forward scatter
PI vs. Annexin-FITC)
PI ?
104
101
FL3-Height 102
103
Viable
Early apoptotic
100 101 102 FL1-Height 103 104
100
Annexine-FITC
Apoptose
Losing DNA
Green
S
Green
S O G1
G1 G2/M
G2/M
Red fluorescence
Lower dilution rate Higher death
Red fluorescence
Higher dilution rate Lower death
FRAGMENTAO DNA
Basolateral medium
Clula Caco-2 Meio E-MEM 10% SFB Baso Lateral Poro apical
CLASSIFICAO BIOFARMACUTICA
Solubilidade e Permeabilidade so os parmetros chaves que controlam a absoro de frmacos (AMIDON, 1995) Classe I: Frmacos de alta solubilidade e alta permeabilidade; Classe II: Frmacos de baixa solubilidade e alta permeabilidade; Classe III: Frmacos de alta solubilidade e baixa permeabilidade; Classe IV: Frmacos de baixa solubilidade e baixa permeabilidade
Manitol
Apical
enterocito
Basal
APICAL
* enterocito CYP3A4
BASAL
APICAL
enterocito
*
CYP3A4
BASAL
APICAL
enterocito
*
BASAL
APICAL
Pgp
OAT P
enterocito
CYP3A4
BASAL
BIODISPONIBILIDADE
Conc. Basal tg
TEMPO (h)
Classificao do frmaco segundo o Sistema de Classificao Biofarmacutico. Papp
Classe 1 Altamente solveis e altamente permeveis > 10-5
Razo dose/solubilidade
< ou = 0,5
> 10-5
< 2 x 10-6 < 2 x 10-6
> 0,5
< ou = 0,5 >1
Papp > 10-6 cm/s: 100% absorvido 10-7 < Papp < 10-6 cm/s: 1 99% absoro Papp < 10-7 cm/s: < 1 % absoro
Bioequivalncia: Alta permeabilidade Papp > 10-5 cm/s Baixa permeabilidade Papp < 10-5 cm/s
Nem sempre a droga mutagnica Aflatoxina do fungo do amendoim ativada perto do ncleo
GENOTOXICIDADE
Lavar com PBS gelado
Lminas Jateadas Agarose 1% Agarose Low melting 0,75% Incubar 1h 37C/5%CO2 Controles DMSO MMS ou H2O2
Tampo de lise
DMSO: Ncleo ntegro (controle NEGATIVO de Genotoxicidade) MMS: Fragmentao nuclear (controle POSITIVO de Genotoxicidade)
Mtodo de classificao de Kobayashi et al. (1995); Miyamae et al. (1998) 1)sem cauda 2) cometas com pequenas caudas (caudas com comprimento < 25% da cabea) 3) Cometas com caudas de tamanho mdio (caudas com comprimento entre 25% e 100% da cabea) 4) Cometas com caudas longas (comprimento da cauda > que a cabea) 5) Cometas mal definidos ou com cabea pequena.