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Conhecimentos bsicos sobre HPLC

Prof. Mrcio Ferrarini Prof. Svio Fujita Barbosa

H - High P - Performance L - Liquid C - Cromatograph

C Cromatografia L Lquida A Alta E Eficincia

Mtodos de anlise disponveis atualmente


Seletivos

Pouco Especficos
Mtodos de anlise

Separao de potenciais interferentes e molculas de interesse - analito

Analito

Introduo s Separaes Cromatogrficas

Separao de potenciais Interferentes ou substncias semelhantes

Amostras Multicomponentes Complexas

Aplicaes
Separao de compostos Identificao de Metablitos Pesticidas

Separao de cidos Nuclicos Poluentes Txicos Controle de Qualidade Bioequivalncia

Separao de substncias de interesse e produtos de degradao


O C OH O C CH3 O
C O

gua

OH OH

CH3COOH

Pesquisa de Impurezas
I HO I O I
LEVOTIROXINA

I NH2 O ONa

I NH2 HO I O I
LIOTIRONINA - 20 x mais potente

O ONa

Introduo s Separaes Cromatogrficas

Mikhail Tswett

Separao de clorofila e xantofila Coluna de vidro


Empacotada com carbonato de clcio finamente dividido

Espcies separadas
formao de bandas coloridas Origem ao nome
Chroma cor Graphein escrever

O que Cromatografia?
Tcnica fsico-qumica de separao!
Migrao diferencial dos componentes de uma mistura de acordo com a partio de suas molculas em duas fases de diferentes caractersticas.

O que partio?
Partio
Distribuio das molculas de uma substncia entre 2 fases com caractersticas diferentes

LEO

GUA

Fases na cromatografia
Fase mvel
Lquida Cromatografia lquida Gasosa Cromatografia gasosa

Fase estacionria
Coluna Camada Delgada

Amostra
Distribu-se entre as fases

Separaes cromatogrficas
Forada atravs de uma FASE ESTACIONRIA Imiscvel e Fixa Amostra

Camada Delgada

Transportada por uma FASE MVEL


Lquido ou gs

Cromatografia liquida

Cromatografia gasosa

Coluna

Cromatografia Em Camada Delgada

http://www.uni-regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/D-TLC_lipophilic_dyes-e.htm

Cromatografia Lquida

http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/colchrom/colchromprocmicroflash.html

Mecanismo de separaes cromatogrficas

Cromatografia Lquida
Primeiros trabalhos
Colunas de vidro
50 a 500 cm

Partculas da fase estacionria


150 a 200 m Assegurar vazes razoveis

Tempo de separao
Longo Vrias horas

Melhorar o processo
Aplicao de bombas de vcuo Bombeamento Perda da eficincia

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia


Aumento da eficincia:
Diminuio dos tamanhos das partculas da fase estacionria Final 1960
Partculas 3 a 10 m

Esta tecnologia exigiu


Equipamentos sofisticados operando a altas presses Diferentes das colunas de vidro
Fluxo por gravidade

HPLC
High Performance Liquid Cromatography

Escopo do HPLC
HPLC ou CLAE
Tcnica analtica de separao mais utilizada 1bilho de dlares anuais Shimadzu
R$ 169.500,00

Escopo do HPLC
Popularidade
Sensibilidade

Determinao quantitativa acurada Separao de espcies no volteis Separao de espcies termolbeis

Classificao dos Mtodos


Duas classificaes:
Meio fsico na qual as fases estacionria e a fase mvel entram em contato
Cromatografia em coluna Cromatografia planar
CCL- cromatografia de camada delgada

Baseia-se
Fase mvel Fase estacionria Tipos de equilbrio

Classificao dos Mtodos


Classificao geral Mtodo Especfico Fase Estacionria Tipo de Equilbrio

Cromatografia lquida (CL) (fase mvel: lquido)

Lquido-liquido
Lquido slido ou adsoro

Lquido adsorvido em um slido


Slido

Partio entre lquidos imiscveis


Adsoro

Troca inica
Excluso por tamanho

Resina de troca inica


Slidos polimricos

Troca inica
Partio/filtrao

Fase lquido ligado Espcies orgnicas ligadas a uma superfcie slida

Partio entre lquidos e superfcie ligada

Cromatografia de fase ligada


Baseia-se:
Distribuio das molculas do analito Entre 2 fases uma lquida e a outra slida De acordo com a afinidade relativa

Fase estacionria quimicamente ligada a superfcie do suporte


Slica rgida

Cromatografia de fase ligada


Dividida de acordo com as polaridades das fases estacionrias e mvel
Fase normal Fase reversa

Fase normal
Fase estacionria
Altamente polar
Slica

Fase mvel
Apolar
Hexano Clorofrmio ter isoproplico

Fase reversa
Fase estacionria
Apolar
Slica + Hidrocarbonetos

Fase mvel
Polar
gua Metanol Acetonitrila

Aplicao Universal
de todos os teste de HPLC Quase todas as molculas orgnicas possuem regies hidrofbicas e por isto interagem com a fase estacionria.

Fase normal X Fase Reversa


Fase normal
Componente menos polar eluido primeiro por ser mais solvel na fase mvel Aumento da polaridade na fase mvel diminui o tempo de eluio

Fase reversa
Componente mais polar eluido primeiro Diminuio da polaridade da fase mvel diminui o tempo de eluio

Cromatografia de partio
Cromatografia de par inico (pareamento de ons)
Separao de espcies inicas Fase mvel
Tampo aquoso Solvente orgnico (metanol ou acetonitrila) Composto inico
Contra on de carga oposta a do analito Formao de um par inico Espcie neutra retida na coluna de fase reversa Ex: Corante Contra on (C4H9)4N+

Cromatografia com Fases Estacionrias Quirais


Separar ismeros opticamente ativos
Enantimeros

Coluna
Suporte de slica gel Ismero
Opticamente ativo Ligado por um polmero.

Cromatografia de Adsoro
Cromatografia lquido-slido Fase estacionria
Adsorvente slido finamente dividido
Alumina Carvo Slica

Cromatografia de Adsoro
Fase mvel
Quanto mais forte for a interao entre fase mvel e estacionria, mais fraca ser a adsoro do analito.

Cromatografia de troca inica


Separao e determinao de ons com base em resinas trocadoras Processo de troca inica
Equilbrio de troca entre ons em soluo e ons de sinal oposto na superfcie de um slido.

Trocadores de ons naturais


Argila e zelitas

Resinas trocadoras sintticas

Cromatografia de troca inica


Stios ativos mais comuns
Resinas trocadoras de ctions
SO3- H+ grupo cido sulfnico COO- H+ grupo cido carboxlico

Resinas trocadoras de nions


N(CH3)3+ OH- grupo de aminas tercirias NH3+ OH- grupo de aminas primrias

Cromatografia de troca inica


Poliestireno

xRSO3-H+ + M x+(RSO3-)x Mx+ + xH+


Slidos Soluo Slidos Soluo

Cromatografia por Excluso de Tamanho


Permeao em gel ou filtrao em gel Aplicada a espcies de alto peso molecular Separao por peso molecular Coluna
Partculas pequenas 10m de slica ou de polmero
Poros uniformes nos quais molculas de soluto e solvente se difundem

Cromatografia por Excluso de Tamanho

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