Tema 11 Biologia Molecular

Tema 11
TCNICAS DE MANIPULACIN GENTICA
Licenciado en Qumica Curso 1
Indice
Tema 11
1. Introduccin: la clonacin molecular 2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento de ADN forneo. 3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo 5. Mtodos de seleccin 6. Obtencin de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR
1. Introduccin: la clonacin molecular
Tema 11
La clonacin consiste en la obtencin de un clon, entendido como un conjunto de elementos genticamente iguales entre si e iguales a su precursor.
- Amplificacin de molculas de ADN por clonacin clular

-Amplificacin de molculas de ADN por clonacin acelular (PCR) - Manipulacin gentica y clonacin de organismos pluricelulares (animales y plantas)
Tema 11
... Dios mo, me han clonado... !!
1. Introduccin: la clonacin molecular Estrategia general del proceso de clonacin
Tema 11
Extraer el gen de inters
insulina
Indice
Tema 11
1. Introduccin: la clonacin molecular 2. Las enzimas de restriccin. Aislamiento de ADN forneo. 3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introduccin del vector/ADN forneo 5. Mtodos de seleccin 6. Obtencin de genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa
8. PCR

Aislamiento y digestin del ADN
Tema 11
Herbert Boyer (Unversidad de Columbia)
Enzimas restriccin
Insercin en molculas vectores
Stanley Cohen (Universidad de Stanford) . Plsmidos bacterianos

con capacidad autnoma de replicacin en la clula hospedadora
2. Las enzimas de restriccin
Tema 11
Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Fosfodiesterasa

de veneno de serpiente Exonucleasas: atacan por un extremo determinad de la
cadena nucleotdica
exonucleasa a o 3 exonucleasa b o 5 Endonucleasas: atacan de forma selectiva una secuencia nucleotdica Enzimas de restriccin
Tema 11
EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN
1. Aislamiento del la ADN 1. Introduccin: clonacin forneo y del ADN vector
molecular
Tema 11
Estrategia general del proceso de clonacin

2. Unin del fragmento de ADN forneo a un vector
3.Introduccin del vectorADN forneo en la clula hospedadora
4. Seleccin transformantes
de
los
Cortar el ADN forneo y el vector con las mismas enzimas de restriccin
5. Estabilidad de informacin gentica Licenciado en Qumica Curso 1
la
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas

Tipo I y Tipo III Actividad restriccin y modificacin Precisan Mg 2+, ATP y S-adenosil-metionina Reconocen una secuencia especfica Recorren un cierto nmero de bases y cortan Tipo II Rompen por la secuencia de reconocimiento Precisan Mg 2+, pero no ATP
Tema 11
Tema 11
Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas

Ejemplos de endonucleasa
extremos cohesivos 5 3 GA A T T C
C T T A AG 3 5 C C G G
G G C C
extremos romos
Tema 11
Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN
EcoR 1 de E.coli
G AAT T C
C T TAA G
Secuencias Palindrmicas
AA G C T T T T C G AA
Hind III de Haemophilus influenza
Tema 11
Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN
EcoR 1 de E.coli
G AAT T C
Secuencias Palindrmicas Extremos cohesivos
C T TAA G
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas Mtodos de aislamiento de ADN forneo
Tema 11
(a) Cortes:
Endonucleasas de restriccin (Tipos I, II, III) Fragmentacin mecnica
(b) Sntesis
Sntesis de DNA a partir de RNAm: Transcriptasa reversa Sntesis qumica directa
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas Sntesis de ADN a partir de ARNm
Tema 11
Transcriptasa reversa
ADN transcripcin
ARN polimerasa
cDNA
ARN traduccin PROTENA RNA La mayora de las clulas

RNA Retrovirus
2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas Sntesis de ADN a partir de ARNm
Tema 11
Indice 1. Introduccin: la clonacin molecular 2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas
Tema 11
3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo 5. Mtodos de seleccin
6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR
molecular
Tema 11

Vector de clonacin
de
los
Cortar el ADN forneo y el vector con las mismas enzimas de restriccin
la
Tema 11
Vectores de clonacin Son vehculos de ADN para ADN, capaces de recibir ADN forneo y replicarlo.
Caractersticas principales Se replican de forma autnoma (origen de replicacin)

Contienen regiones no esenciales para su multiplicacin y estabilidad
Tema 11
Tipos de vectores: Plsmidos Permiten insertar hasta 20 kb de ADN pero son ms eficaces con insertos ms pequeos (<10kb). Contienen genes de resistencia a antibiticos.
Virus Permiten insertar 15-20 kb. El sistema de infeccin del virus permite la entrada del ADN en E. coli. Los virus de cadena sencilla tienen aplicaciones especiales para secuenciar y realizar mutagnesis.
Vectores hbridos: csmidos. Permiten insertar hasta 40 kb.
Tema 11
Tipos de vectores de clonacin Plsmidos (bacterianos)
Virus Csmidos (laboratorio) YACs (levaduras)
Tema 11
Plsmidos
ADN Plasmdico ADN
pBR322
ADN Plasmdico -Control relajado -Fenotipo seleccionable -Cierto N de sitios de restriccin -Bajo PM (4 363 bp) (transformacin con plsmidos 10000bp es poco eficiente
Tema 11
Virus Csmidos (laboratorio) YACs (levaduras)
Tema 11
Virus: se emplea como vector, junto con la capacidad que poseen para introducir el ADN forneo en la clula hospedadora Para bacterias: Fago l y derivados, Fago M13 Para plantas: CaMV Para mamferos: SV40
Tema 11 Fago l
Virus
-El corte por los sitios cos y el empaquetamiento en la cpsida puede hacerse in vitro. La cpsida admite entre 38 y 53 Kb (-20% y + 10% del DNA l). -Se introduce en la bacteria hospedadora por transduccin
Tema 11
Adsorcin de particulas virales a una bacteria
Tema 11
SIDA
Tema 11
Virus Csmidos (laboratorio)

Mezcla plsmido y virus
YACs (levaduras), contienes sitios caractersticos de la funcionalidad de los cromosomas

Tema 11

6. Genotecas
molecular
Tema 11

de
los
la
3. Vectores de clonacin y unin del framento de ADN
Tema 11
Enzimas de restriccin
Vector ADN
Tema 11

6. Genotecas
molecular
Tema 11

de
los
la
4. Hospedadores. Introduccin del ADN forneo
Tema 11
Mtodos de insercin del ADN-vector en clula huesped

Transformacin: ADN plasmdico en clula. CaCl2 (mejora el proceso). Para plsmidos < 20 Kb Infeccin: directa del virus empaquetado in vitro Transduccin: ADN vrico sin cpsida (menor rendimiento)
Microinyeccin: para clulas grandes (eucariotas) con micromanipulacin.

Pistola o Bombardeo de partculas: para transformar vegetales. Conjugacin: celular del ADN de dos clulas
W, Au Fusin de Protoplastos: intercambio ADN, dos clulas sin pared celular
Tema 11

6. Genotecas
molecular
Tema 11

de
los
la
5. Mtodos de seleccin
Tema 11
MTODOS DE SELECCIN Resistencia a antibiticos Genes marcadores (gen b-galactosidasa) GFP (green fluorescent protein) Hibridacin de colonias
5. Mtodos de seleccin Resistencia a antibiticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector, en este caso a ampicilina y a tetraciclina
El ADN forneo se inserta en el gen de resistencia a Ampicilina
Tema 11
Plsmido pBR322
5. Mtodos de seleccin Resistencia a antibiticos

La resistencia la confieren genes que porta el vector
Sin plsmido Sin inserto Con plsmido Con inserto Con plsmido Sin inserto
Tema 11
Con tetraciclina
Con ampicilina y tetraciclina
Tema 11
Tema 11
Gal Genes marcadores (ej: gen b-galactosidasa)

Amp
(X-gal) pUC19 5-Br-4-Cl-3-indolil-b-galactsido Br-Cl-indol + galactosa (Azul) Ori
Inactivacin insercional (introducir el DNA foraneo en el medio del marcador)
Insercin gnica positiva (Unir el gen marcador al DNA foraneo)
5. Mtodos de seleccin Genes marcadores (gen b-galactosidasa)
Tema 11
Gal + inserto
Gal
Amp
Amp
Ori Plasmido pUC19 Plasmido pUC19
Ori
b-galactosidasa
Tema 11
pUC19 = plsmido
b-galactosidasa + ADN forneo
Tema 11
Tema 11
GFP (green fluorescent protein)
Tema 11
GFP (green fluorescent protein)
Vector
GFP-ACTIN
CFP-GOLGI GFP-ENDO M-GFP RFP-MITO CFP-MITO YFP-NUC GFPPEROXI YFP-ER GFP-TUB
Localizacin
Actina
Ap. De Golgi Endosomas Membrana Mitocondria Mitocondria Ncleo Peroxisomas Retculo endoplsmico Tubulina
Excitacin (nm)
488
420 488 488 550 420 515 488 515 488
Emisin (nm)
510
475 510 510 600 475 530 510 530 510
molecular
Tema 11

de
los
la
Indice
Tema 11
1. Introduccin: la clonacin molecular 2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo 5. Mtodos de seleccin 6. Genotecas 7. Electroforesis en geles de agarosa 8. PCR
Genotecas
Tema 11
Genoteca: coleccin de clones que contiene todo el genoma de un organismo. Tipos de genotecas: Genmicas Parciales ADNc. Coleccin de ARNm Tipos de vectores: Plsmidos (Genotecas parciales) Fagos (Genotecas genmicas pequeas y de ADNc) Csmidos, BAC (genotecas genmicas complejas)
6. Obtencin de genotecas
Tema 11
Utilizando un virus
Utilizando un plsmido
5. Mtodos de seleccin Hibridacin de colonias

Consiste en detectar secuencias de DNA en colonias transformadas mediante hidridacin in situ con sondas marcadas Obtencin de la sonda marcada: marcaje radioactivo: (32P) marcaje desoxinucletidos fluorescentes
Tema 11
Indice
Tema 11
1. Introduccin: la clonacin molecular 2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas 3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN 4. Hospedadores. Introduccin del vector-ADN forneo 5. Mtodos de seleccin 6. Genotecas
7. Electroforesis en geles de agarosa

8. PCR
Tema 11
TCNICAS ELECTROFORTICAS
Tema 11
Se basan en la migracin diferencial de las molculas a separar en un campo elctrico. Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA) En la electroforesis en gel la fuerza que provoca la migracin de las molculas es el campo electrico, pero el gel acta como filtro molecular, relentizando la migracin su migracin en funcin de su tamao
Tema 11
ELECTROFORESIS. SOPORTES
Tema 11
- Geles de acrilamida (protenas, geles de secuenciacin de ADN)

O C CH2 CH NH2 CH2 CH O C NH CH2 NH O C CH CH2
Gelificacin qumica
Acrilamida
N,N`-Metilenbisacrilamida
- Geles de agarosa (los ms usuales para ADN)
Gelificacin trmica
Tema 11
ELECTROFORESIS DE ADN
Disolver la agarosa a la concentracin deseada en una solucin
salina TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBS mediante calentamiento
Dejar enfriar hasta unos 50C y aadir Bromuro de Etidio
Bromuro de Etidio
C2H5

La agarosa es el polmero usado para la separacin.
Tema 11

La agarosa se mezcla con un tampn.
Tema 11

La agarosa se disuelve en el microondas.
Tema 11

Se preparan la cubeta y el peine.
Tema 11
Tema 11
Se aade el polmero disuelto a la cubeta y se espera hasta su gelificacin.
Tema 11
El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin
TAE Se procede a cargar los pocillos con las muestras Se procede a conectar a una fuente de electroforesis

Formados los pocillos, se coloca en ellos cada muestra, incluidos los patrones.
Tema 11

Cada muestra forma una banda azul que correr en la agarosa dependiendo de su tamao.
Tema 11
Tema 11
El gel se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con solucin
TAE
Tema 11
El gel se retira y el bromuro de etidio ligado al ADN se visualiza con transiluminador de UV, apareciendo bandas fluorescentes. Se coloca el gel en un transiluminador de luz UV Se visualizan las bandas de ADN teidas con el bromuro de etidio.
Tema 11
La movilidad electrofortica del ADN en los geles de agarosa es
inversa a su tamao
1Kb
3.0 2.0 1.6 1.0 0.5
BKTBKT-O de H. pluvialis
Indice
Tema 11
8. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Tema 11
Tema 11
Kary Mullis. Premio Nobel de Qumica en 1993

Descrubri la PCR en 1985, cuando trabajaba para Cetus Corp. Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion similar molecules in an afternoon
Tema 11
PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA.
DNA
(molcula sencilla)
PCR
amplificacin
Muchas moleculas del mismo ADN
Tema 11
PCR es bsicamente una tcnica de amplificacin del DNA. Controlando la temperatura
DNA
(doble hlice)
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G -A T G C A T G C A T G C * *

Cortos primers de DNA especficos que hibridan con la cadena que tiene que ser copiada
5 3
los dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G T -A T G C A T G C A T G C * *

5 3
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G T A -A T G C A T G C A T G C * *

5 3
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G T A C -A T G C A T G C A T G C * *

5 3
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G T A C G -A T G C A T G C A T G C * *

5 3
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G T A C G T -A T G C A T G C A T G C * *

5 3
Tema 9
Sntesis por DNA polimerasa -T A C G T A C G T A -A T G C A T G C A T G C * *

5 3
Tema 9
Despus del primer periodo de sntesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1
Extensin de la cadena
Cadena original de DNA
Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?
Tema 11 Tema 9
Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)
Tema 11 Tema 9
Primero, la fusin separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (90 ~ 100C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa 2
1
Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molcula original
Tema 11 Tema 9
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Fusin 95C
Hibridizacin 50-60C
Extensin de La cadena 75C
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
2do Ciclo 95C 50 - 60C 75C
Mltiples ciclos darn un incremento exponencial de copias

8. PCR (Polymerase Chain Reaction) ADN-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq polimerasa)

Parque Nacional de Yellowstone
Hey, Boo Boo pescamos lasTap para amplificar los sandwiches?
Tema 11
Ok Yogy
Tema 11
Tema 11
Pelo humano
Indice
Tema 11
8. Mtodos de secuenciacin del ADN

METODO DE SANGER PARA LA SECUENCIACIN DE DNA
Tema 11
U K J K K
Tema 11
TCNICAS DE MANIPULACIN GENTICA

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1. Introduccin: la clonacin molecular

- Amplificacin de molculas de ADN por clonacin clular

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1. Introduccin: la clonacin molecular

... Dios mo, me han clonado... !!

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1. Introduccin: la clonacin molecular Estrategia general del proceso de clonacin

Extraer el gen de inters

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1. Introduccin: la clonacin molecular

Herbert Boyer (Unversidad de Columbia)

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2. Las enzimas de restriccin

Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas Fosfodiesterasa

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2. Las enzimas de restriccin

EcoRI actuando sobre una secuencia de ADN

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1. Aislamiento del la ADN 1. Introduccin: clonacin forneo y del ADN vector

Estrategia general del proceso de clonacin

3.Introduccin del vectorADN forneo en la clula hospedadora

Cortar el ADN forneo y el vector con las mismas enzimas de restriccin

5. Estabilidad de informacin gentica Licenciado en Qumica Curso 1

2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas

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2. Las enzimas de restriccin

Los cidos nucleicos son hidrolizados por nucleasas

2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas

Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN

Hind III de Haemophilus influenza

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2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas

Accin de endonucleasas de restriccin Tipo II: corte ADN

Secuencias Palindrmicas Extremos cohesivos

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2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas Mtodos de aislamiento de ADN forneo

2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas Sntesis de ADN a partir de ARNm

ARN traduccin PROTENA RNA La mayora de las clulas

2. Aislamiento del ADN forneo. Endonucleasas Sntesis de ADN a partir de ARNm

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Indice 1. Introduccin: la clonacin molecular 2. Aislamiento de ADN forneo. Endonucleasas

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

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1. Aislamiento del la ADN 1. Introduccin: clonacin forneo y del ADN vector

Estrategia general del proceso de clonacin

3.Introduccin del vectorADN forneo en la clula hospedadora

Cortar el ADN forneo y el vector con las mismas enzimas de restriccin

5. Estabilidad de informacin gentica Licenciado en Qumica Curso 1

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Caractersticas principales Se replican de forma autnoma (origen de replicacin)

Licenciado en Qumica Curso 1

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

Tipos de vectores de clonacin Plsmidos (bacterianos)

Virus Csmidos (laboratorio) YACs (levaduras)

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3. Vectores de clonacin y unin del fragmento de ADN

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