Quinta-feira, 24 de junho de 2010

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Ncleo de Pesquisas de Produtos Naturais

Prof Luzineide W. Tinoco

Alunos : Alda Ernestina dos Santos e Vitor Soares
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Sumrio
INTRODUO
*LC-RMN;
*Modos de operao;
*O uso de SPE;
OBJETIVOS
METODOLOGIA
RESULTADOS E DISCUSSES
*Anlise por LC-UV-SPE-RMN;
*Comparao de Probes;
*Experimentos RMN 2D;
*Identificao do Carvacrol.
CONCLUSES




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Introduo
LC-RMN
LC-RMN X Pesquisa Tradicional de PN;
Baixa sensibilidade Espectrmetros cada vez
mais potentes;
Uso de solventes deuterados ou supresso do
solvente;
On-line flow Baixa concentrao do analito
Baixa S/N;
Reduo da taxa de fluxo (vazo) Aumenta S/N,
no entanto a difuso pode influenciar na separao;




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Modos de operao
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Introduo
O uso de SPE

Permite concentrar o analito;

Elimina solventes detectveis por RMN
1
H;

Elimina o uso de grande volume de solvente
deuterado;

Tcnicas de supresso do solvente no so
obrigatrias;



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Objetivo
Investigar a possibilidade do sistema on-line LC-UV-
SPE-RMN-MS combinado com o uso de uma sonda
cryoflow, combinando o volume de eluio dos
cartuchos de SPE e descrever sua aplicao na anlise
de uma mistura complexa.
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Metodologia
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Experimento com LC-UV-SPE-RMN
Foi utilizado o sistema on-line LC-UV-SPE-RMN.
O espectrmetro utilizado foi: RMN Bruker DPX-400 MHZ com probe LC de 4-mm
13
C
1
H com volume ativo de 120 mL.
Nesse primeiro experimento no foram obtidos espectros de RMN adequados, pois
a concentrao dos analitos estava baixa.
Portanto a anlise foi repetida em equipamento mais sensvel acoplado a um MS.
O LC-UV-SPE-RMN-MS.
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LC-UV-SPE-RMN-MS
RMN AV-600 (ultra-blindado).
Probe com volume ativo de 20 mL.
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Experimentos no RMN DRX-600 MHZ
Espectro de RMN
1
H usando seqncia de pulsos baseada na verso 1D da
seqncia de pulsos do NOESY.

Experimentos 2D :

1
H-
1
H TOCSY: largura do espectro, 8389 Hz; tempo de aquisio, 0.12s; intervalo de
relaxao, 2s; spin locking pulse, 60 ms; e 16 scans para cada um dos 160
incrementos.

1
H
13
C HMQC: largura do espectro, 6067 Hz n a dimenso F
2
(
1
H) e 25000 Hz na
dimenso F
1
(
13
C); tempo de aquisio, 0.17s; intervalo de relaxao, 2s; fez-se de 32-
128 scans por incremento (256 incrementos).

1
H
13
C HMBC: largura do espectro, 8993 Hz na dimenso F
2
(
1
H) e 33557 Hz na
dimenso F1 (
13
C); tempo de aquisio, 0.17s; intervalo de relaxao, 2s; mixing time
de 65 ms; e fez-se de 64- 256 scans por incremento (256 incrementos).
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Resultados e Discusses
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Anlise por LC-UV-SPE-RMN
Escolha do sinal para analisar.
Captura do analito responsvel
pelo sinal.
Pico 6 foi analisado e constatou-se
atravs do UV e do tempo de
reteno que seria carvacrol.
Foi confirmado atravs do
espectro de RMN
1
H.
Foi efetuada a seleo dos sinais
assinalados, porem os sinais 1,2,3,4
e 5 no apresentaram espectro de
RMN adequado.
Baixa concentrao.

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Taxifolin
Rosmarinic acid
Aromadendrin
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eriodictyol
Naringenin e
apigenin
Carvacrol
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Foram realizados testes para atingir um melhor rendimento no
armazenamento dos analitos no cartucho de SPE.
Testes com padres de carvacrol e cido rosmarnico.
Resultado: Observou-se que a medida que diminua a
concentrao do solvente acetonitrila os analitos ficavam mais
retidos nos cartuchos.
Utilizou-se 10% de Acetonitrila em gua acidificada com cido
frmico 0,1% v/v e vazo de 0.6 mL/min.
O mecanismo de reteno dos analitos no cartucho de SPE est
relacionado com a polaridade.
Anlise por LC-UV-SPE-RMN
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600 MHz
1
H RMN
Espectro do pico 5,
mistura de flavonides.
(A) Pulso de supresso
do solvente.
(B) Sem supresso de
solvente.
sinais em 12.2 e 13 ppm.
Two flavonoids trapped
in the same SPE.
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Comparao de Probes

Flow probe 120 L X Cryoflow probe 20 L;

Cryoprobe aumenta a S/N pelo resfriamento do
coil;


SPE
Acetonitrila d
3
Flow Probe 120 L
SPE
Acetonitrila d
3
570 L
190 L
CryoFlow Probe 20 L
Diluio do analito
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COLEGATE, S. M. & MOLYNEUX, R. J., 2008.
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CLARIDGE, 2009.
Aprimoramento dos Probes
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CLARIDGE, 2009.
Cryoflow Probe
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Experimentos RMN 2D
Heteronuclear
1
H-
13
C .

1
H-
13
C HMBC e
1
H-
13
C HMQC .
Permitem a observao de prtons e carbonos que esto conectados
via uma e mltiplas ligaes, respectivamente. Sendo assim possvel
observar se h interrupes no sistema de spins de prtons.
O experimento de
1
H-
13
C HMBC pode revelar o acoplamento a longa
distncia do prton desblindado das hidroxilas de flavonides.
Concentrao multiple trapping.
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600 MHZ
1
H
13
C
HMQC do pico 5.
Trs trapping on the
same SPE.

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os sinais das OH em
12,2 mostra os cross-
peaks com os carbonos
98, 105 e 167.

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Experimentos RMN 2D
4,62 ppm 5,06 ppm

6,87 ppm- 7,36 ppm

Singletos:
5,95 ppm
6,01 ppm
11,57 ppm
Flavonoide
1H-1H TOCSY
Aromadendrina
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Identificao do Carvacrol
HMQC
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Identificao do Carvacrol
HMBC
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Concluses

LC-UV-SPE-RMN-MS com cryoprobe aumento
da sensibilidade observao direta do espetro
de
13
C;

Forneceu vrias Vantagens: uso de solventes
prticos na eluio , supresso do solvente no
obrigatria, viso dos H trocveis.
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Bibliografia Consultada
ANDERSEN, O. M.; MARKHAN, K. R. Flavonoids: Chemistry,
Biochemistry and Applications. CRC Press: New York, 2006.

CLARIDGE, T.D.W. High Resolution NMR Techniques in Organic
Chemistry.2ed.Elsevier:Oxford,2009.

COLEGATE, S. M.; MOLYNEUX, R. J. Bioactive natural products:
detection, isolation and structural determination. 2ed. CRC
Press: New York, 2008.

GRIFFITHS, L. Optimization of NMR and HPLC Conditions for LC-NMR.
Analitycal Chemistry, n 67. 1995. p.4091 -4095.


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LOMMEN, A.; GODEJOHANN, M.; VENEMA, D. P.; HOLLMAN, P. C. H.;
SPRAUL, M. Application of Directly Coupled HPLC-NMR-MS to the
Identification and Confirmation of Quercetin Glycosides and
Phloretin Glycosides in Apple Peel. Analitycal Chemistry, n 72. 2000.
p.1793-1797.

RUSSELL D. J.; HADDEN, C.E.; MARTIN, G.E.; GIBSON, A.A.; ZENS,
A.P.; CAROLAN, J.L. A Comparison of Inverse-Detected
Heteronuclear NMR Performance:Conventional vs Cryogenic
Microprobe Performance. Journal of Natural Products, n.8,
v.63.2000.p.1047-1049.

Bibliografia Consultada
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Obrigado!