Disciplina: Introduo biologia molecular

Discente: Mrcio Jos de Arajo

Vitamina A
Sistema visual;
Crescimento e desenvolvimento;
Antioxidante (radicais livres sistema
imunolgico);
Incapacidade humana de sintetizar;
Origem animal Vitamina A Pr-formada (steres
de Retilina);
Origem vegetal Pr Vitamina A (Carotenides)
Fonte: SBP (2007)
Estrutura da Presena da molcula de retinol nos
Caratenides
Estudos sobre a hidroxilase em plantas (Duplicao,
Clonagem e caracterizao);
Em dicotiledneas:
Arabdopsis, tomate e pimenta (Sun et al. 1996; Bouvier et al.
1998; Tian and DellaPenna 2001; Galpaz et al. 2006)
Em monocotiledneas:
Sorgo, arroz e milho (Vallabhaneni et al. 2009; Yan et al.
2010)
Tubrculos de batatas
Polimorfismo em loco
Variao Caroteno (acumulao)
Antisenso silenciado aumento de 14 vezes no acumulo de
Caroteno

Milho
ZmHYD3 - Padres de expresses correlacionados com o
acmulo de hidroxilase (endosperma);
Gene CrtR-B1 Aumento de Carotenoides no endosperma;
Genes alvo
Melhoria na pr-vitamina A nos alimentos;
Principais fontes de energia para o ser humano;
Gros de trigo
Importante papel na manuteno da caloria necessria para
o crescimento da populao mundial.
Gros maduros Desprovidos de Pr-vitamina A

Trigo Ploidia
Tetraplide (Triticum turgidum ssp. Durum) Amarelo,
Lutena(carotenide)
Hexaplide (Triticum aestivum) Panificao, Seleo para
baixos nveis de carotenides;
Acumulao de carotenides no endosperma
Acmulo de lutena (no pr-vitamina A) (trigo Durum);
Pr-vitamina A (Perda no gro maduro);


Estudar as informaes moleculares das estruturas
dos genes que regulam a acumulao de
carotenides nos gros de trigo;
Aumento do acumulo de carotenides pelo
bloqueio da sntese de ,-hidroxilase;
Manipulao dos genes responsveis pela
expresso do -Caroteno.
Isolamento de 3 homlogos de cada -hidroxilases
(HYD1 e HYD2) do trigo
Caracterizao das funes em bactrias;
Expresso dos diferentes perfis em tecidos vegetais;
Desenvolvimento e comparao dos gros de trigos
tetraploide e hexaploide;
Nveis de carotenides analisados em paralelo com anlise
de expresso gnica;


Mudas de trigo Kronos (tetraploide) e UC1041 (hexaploide)
sob luz natural;
Selecionados como parentais TILLING (Targeting Induced
Local Lesions in Genomes) Populao mutante
Fonte para seleo futura da expresso/no dos genes mutantes da
biossntese de carotenides no trigo.
Anlise de crescimento e emergncia
Coleta de gos entre 5 e 30 DAP (intervalo de 5 dias)
Coleta de gros maduros (40 DAP)
Amostras de tecidos vegetais estocados em -80C
RNA extrado dos tecidos vegetais;
Reagente Trizol (cf. instrues do fabricante)
Concentrao e purificao A260/A280 e A260/A230
(Nanodrop ND-1000)
Teste de agarose;
Extrao de DNA Genmico
Metodologia de Dvorak (1988)
Genes de -hidroxilase em Arabdopsis , milho e
sorgo
Sequncias homlogas (2 genes) em trigo (Dados pblicos -
ESTs)
1 homlogo RACE
Transcrio Reversa (RT-PCR) RNA cDNA
PCR
Desnaturao
Hibridao
Polimerizao
Clonagem em vetor pENTR/D-TOPO (Invitrogen)
Transformao
Vetor comercial (E.coli)
Colnias selecionadas inoculao em meio lquido
DNA Plasmidial extrado Sequenciado com M13 forward
reverse primer
DNA Genmico
Amplificao (PCR)
Clonagem vetor pGEM-T easy Promega
Sequncia avaliada com Vector NTI
Genes da -hidroxilase (HYD) no trigo atribudo a diferentes
cromossomos
Relao colinear Arroz-Trigo



Presena de possveis genes HYD Nested PCR
Primers projetados para regies mais conservadas dos genes HYD
em monocotiledneas e dicotiledneas;
Amplificao Clonagem Transformao
Seleo de colnias
Extrao de DNA plasmidial
Sequenciamento com primer M13 forward primer
No identificou -hidroxilase adicional no trigo
Caracterizao da funo da -hidroxilase no trigo em E.coli
Genes da -hidroxilase identificados no trigo
Subclonados Transformados em E. coli JM109(DE3) clulas competentes (pAC-
Beta, pAC-Delta e pAC-Epsilon)
Genes que biosintetizam -Caroteno, -Caroteno e -Caroteno
Clulas bacterianas cultivadas Centrifugadas para extrao de carotenides

RNA extrado Tratado com RNase-free DNase I
Dois conjuntos de primers
1 - Amplificar todos 3 homlogos e examinar a expresso
especfica de cada gene;
2 - Determinar as diferentes expresses relativas de cada
homlogo;
Curvas padro com base em 2 housekeeping (Ta2291
e Ta54227)
Comparar abundncia relativa Genes HYD e seus homlogos
e variao de LCY-E (Lycopene -cyclase)
Gos no estgio de desenvolvimento; Gro maduros
Pesados, modos;
Quantificao HPLC (Britton 1995; Schiedt and Liaaen-Jensen
1995).
Anlise estatstica
Teor de carotenides e genes de expresso HYD Tukey
Intervalo de confiana de 95%
Homlogos especficos HYD e LCY-E
Teste t de Student

Dois genes da -hidroxilase no trigo foram clonados e
esto intimamente relacionados com homlogos de
monocotiledneas;








Homlogos da -hidroxylase no trigo
demonstraram maior atividade de
hidroxilao em -ring





Gro 1 (4-10 DAP) e gro 2 (10-16 DAP) Fase inicial
Gro 3 (16-20 DAP) e gro 4 (20-25 DAP) Fase de enchimento dos gros
Gro 5 (25-35 DAP) e gro 6 (35-45 DAP) Fase de maturao









a) Expresso da HYD1 e HYD2 nos diferentes tecidos vegetais do trigo durante o
desenvolvimento dos gro determinados pela anlise de real time qPCR










b) Expresso da HYD1 e HYD2 nos diferentes tecidos vegetais do trigo durante
o desenvolvimento dos gro determinados pela anlise de real time qPCR

HYD1 dominante sobre HYD2 na transcrio da -
hidroxilase em 35-45 DAP (gro 6) para ambos trigos
tetraplide e hexaplide (18 e 28 vezes mais que
HYD2, respectivamente.








Anlise de HPLC Picos de 1-8: 1 = Neoxantina; 2 = trans - violaxantina; 3 = cis
violaxantina; 4 = Lutena;
5 = cis Zeaxantina; 6 = Clorofila B; 7 = Clorofila A; 8 = -Caroteno



Tecidos e gros possuem subfuncionalizao e regulao de
expresso diferenciadas quanto aos genes e seus homlogos;
HYD1 e HYD2 desempenham papis distintos nos diferentes tecidos
e estgios de desenvolvimento dos trigos tetra e hexaplide
(Possivelmente por necessidades metablicas);
Desempenham contribuio diferencial para a hidroxilao da -
Ring (Diversificao funcional dos parlogos) ;
Seleo natural/humanos - Utilizar esta diferenciao para gerar
distintos perfis de carotenides no trigo;
Estudos da caracterizao funcional do genes da -hidroxilase
utilizando a tcnica da clonagem permitir a utilizao de mutantes
que reduzam ou impedem a atividade de hidroxilao da Ring.








QIN, Xiaoqiong et al. Cloning and comparative analysis of carotenoid -hydroxylase genes provides
new insights into carotenoid metabolism in tetraploid (Triticum turgidum ssp. durum) and hexaploid
(Triticum aestivum) wheat grains. Plant molecular biology, v. 80, n. 6, p. 631-646, 2012.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE PEDIATRIA SBP. Deficincia de vitamina A. Rio de Janeiro: Departamento
cientfico de nutrologia da sociedade brasileira de pediatria. 2007. Disponvel em:
http://www.sbp.com.br/img/documentos/doc_deficiencia_vitamina_A.pdf. Acesso em: abr. 2014.
Sun Z, Gantt E, Cunningham FX Jr (1996) Cloning and functional analysis of the b-carotene hydroxylase
of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 271:2434924352