UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE TECMAC

DIVISIN DE BIOTECNOLOGA

Mtodos Cromatogrficos



Presenta:
M. en C. Jess Alarcn Bonilla





Contenido.
I. Apertura
I. Bienvenida
II. Contrato de aprendizaje
III. Diagnstico
II. Desarrollo del contenido
I. Generalidades
II. Tipos de cromatografa
III. Mtodos cromatogrficos
IV. Conceptos generales
V. Sesin experimental
III. Cierre
I. Resumen y conclusiones
II. Evaluacin final
III. Evaluacin de sastisfaccin al cliente




Generalidades.
Historia (siglo XIX):
David Day (geologo e ing. en minas).- separacin de
los crudos del petrleo.
Mikhail Tswett (botnico y fisicoqumico).- separacin
de componentes de extractos de hojas






Generalidades.
Historia (siglo XIX):
David Day (geologo e ing. en minas).- separacin de
los crudos del petrleo.
Mikhail Tswett (botnico y fisicoqumico).- separacin
de componentes de extractos de hojas

Componentes en una tcnica cromatogrfica
Soporte
Fase estacionaria
Fase mvil
Muestra
Alcuota





Divisin de la cromatografa.
Por el tipo de soporte-fase estacionaria:

Laminar: fase estacionaria en dos dimensiones
En papel.- soporte-fase estacionaria = papel
En capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC).-
Soporte: vidrio, acero inoxidable, alumnio
Fase estacionaria: adsorbente como almina o silica gel






Divisin de la cromatografa.
Por el tipo de soporte-fase estacionaria:

Laminar: fase estacionaria en dos dimensiones
En papel.- soporte-fase estacionaria = papel
En capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC).-
Soporte: vidrio, acero inoxidable, alumnio
Fase estacionaria: adsorbente como almina o silica gel

En columna: fase estacionaria en tres dimensiones
Normal
Instrumental.-
De lquidos de alta resolucin (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
De gases (Gas Chromatography, GC)





Divisin de la cromatografa.
Por el tipo de soporte-fase estacionaria:

Laminar: fase estacionaria en dos dimensiones
En papel.- soporte-fase estacionaria = papel
En capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC).-
Soporte: vidrio, acero inoxidable, alumnio
Fase estacionaria: adsorbente como almina o silica gel

En columna: fase estacionaria en tres dimensiones
Normal
Instrumental.- Alta capacidad de resolucin, sensibilidad, versatilidad,
corto tiempo de respuesta y gran eficacia
De lquidos de alta resolucin (High Performance Liquid Chromatography, HPLC):
Sistema a alta presin, fase estacionaria (5-50 mm), velocidad de
desplazamiento lineal alta. Analtica o Preparativa

De gases (Gas Chromatography, GC)





Mtodos cromatogrficos.
De adsorcin

De exclusin

De intercambio inico

De reparto

De afinidad









Cromatografa de adsorcin.
Fuerzas intermoleculares entre las superficies de la fase estacionaria y los
componentes de la muestra estableciendose la adherencia por
enlaces dbiles tipo:
+ Fuerzas de London
+ Fuerzas electrostticas
+ Transferencia de cargas
+ Puentes de hidrgeno








Cromatografa de adsorcin.
Fuerzas intermoleculares entre las superficies de la fase estacionaria y los
componentes de la muestra estableciendose la adherencia por
enlaces dbiles tipo:
+ Fuerzas de London
+ Fuerzas electrostticas
+ Transferencia de cargas
+ Puentes de hidrgeno

La adsorcin a la fase estacionaria aumenta al incrementar la polaridad, por
tanto aplica para muestras poco polares o apolares.

+ Adsorbentes.- materiales porosos como almina, silica gel, celulosa,
almidn, etc.

+ Eluyentes.- con viscosidad adecuada, compatibles, miscibles con la
muestra, pureza adecuada y fcil elimniacin.








Cromatografa de adsorcin.
VENTAJAS
Sencillo, uniforme y reproducible
Sensible a diferencias estricas en molculas similares
Variacin amplia de la polaridad de la fase mvil
Aplicable para grandes cantidades de muestra
Aplicable para separacin de mezclas en base a su polaridad








Cromatografa de adsorcin.
VENTAJAS
Sencillo, uniforme y reproducible
Sensible a diferencias estricas en molculas similares
Variacin amplia de la polaridad de la fase mvil
Aplicable para grandes cantidades de muestra
Aplicable para separacin de mezclas en base a su polaridad

CARACTERSTICAS DE ADSORBENTES (FASE ESTACIONARIA)
Con gran rea superficial
Puntos polares accesibles y reproducibles







Cromatografa de adsorcin.
VENTAJAS
Sencillo, uniforme y reproducible
Sensible a diferencias estricas en molculas similares
Variacin amplia de la polaridad de la fase mvil
Aplicable para grandes cantidades de muestra
Aplicable para separacin de mezclas en base a su polaridad

CARACTERSTICAS DE ADSORBENTES (FASE ESTACIONARIA)
Con gran rea superficial
Puntos polares accesibles y reproducibles

MATERIALES ADSORBENTES
Sacarosa, Celulosa, Almidn, CaCO3, MgCO3, CaO, Silica gel, Carbn act. MgO, Almina
Aumento del poder ADSORBENTE







Cromatografa de adsorcin.
FASE MVIL
Consideraciones:
Viscosidad adecuada
Estabilidad
Compatibilidad con la deteccin
Solubilidad con respecto a la muestra
Pureza apropiada
Facilidad de eliminacin
Mxima resolucin para la separacin de la muestra









Cromatografa de adsorcin.
FASE MVIL
Consideraciones:
Viscosidad adecuada
Estabilidad
Compatibilidad con la deteccin
Solubilidad con respecto a la muestra
Pureza apropiada
Facilidad de eliminacin
Mxima resolucin para la separacin de la muestra

OBSERVACIONES
La extensin de la adsorcin se predice cuantitativamente segn su grupo
funcional . El conjunto de disolventes agrupados se llama SERIES
ELUOTRPICAS. Cuando mas polar sea el soluto adsorbido mas polar
ser la fase mvil elegida










Cromatografa de adsorcin.
SECUENCIA GENERAL DE ADSORCIN DE GRUPOS FUNCIONALES

Decremento de Polaridad
H+/OH-, R-OH, R-NH2, R-SH, R-NO3, R-CHO, R-CO-R, R-COO-R, R-X, -C=C-, -C-C-
Aumento de adsorcin










Cromatografa de adsorcin.
SECUENCIA GENERAL DE ADSORCIN DE GRUPOS FUNCIONALES

Aumento de Polaridad
H+/OH-, R-OH, R-NH2, R-SH, R-NO3, R-CHO, R-O-R, R-COO-R, R-X, -C=C-, -C-C-
Aumento de adsorcin

DISOLVENTES MAS COMUNES

NO POLAR: Ciclohexano, Tetracloruro de carbono, Tolueno, Benceno, Cloroformo,
Eter etlico, Acetato de etilo, Acetona, n-Propanol, Etanol, Metanol, Agua,
Piridina, cidos orgnicos, cidos y bases inorgnicas: POLAR










Cromatografa de reparto.
- Separacin de componentes de muestra por
diferencia de afinidades entre fase estacionaria y
fase mvil.
- Lo semejante disuelve lo semejante
- Aplica para muestras polares.
- Enlaces similares a la cromatografa de adsorcin.








Cromatografa de reparto.
- Separacin de componentes de muestra por
diferencia de afinidades entre fase estacionaria y
fase mvil.
- Lo semejante disuelve lo semejante
- Aplica para muestras polares.
- Enlaces similares a la cromatografa de adsorcin.
- Fase estacionaria, lquido embebido en un soporte.
- Fase mvil o eluyente, segundo lquido de polaridad
diferente al de la fase estacionaria como soluciones
mixtas, soluciones amortiguadoras, soluciones salinas
o agentes acomplejantes
- Dos variantes.
- Fase directa: f. estacionaria polar/f. mvil no polar
- Fase reversa: f. estacionaria no polar/f.mvil polar








Cromatografa de reparto.
SOPORTES COMUNES
Fase DIRECTA: Tierra de diatomeas, Silica gel, Celulosa, Almidn
Fase REVERSA: Polvo de vidrio, Gomas, Acetil-Celulosa, Polimeros
Cromatografa de reparto.
SOPORTES COMUNES
Fase DIRECTA: Tierra de diatomeas, Silica gel, Celulosa, Almidn
Fase REVERSA: Polvo de vidrio, Gomas, Acetil-Celulosa, Polimeros
FASES ESTACIONARIA / MVIL
DIRECTA
Agua n-butanol, isobutanol
Agua + cido benceno, tolueno, c-hexano, hexan
Agua + base/amortiguador cloroformo
Sol. Alcohlicas (MeOH, EtOH) Acetato de etilo
Metanol, Etanol, eter metlico, etilenglicol
Formamida Metil Etil Cetona
Glicoles (etileno, propileno, glicerol) Piridina

Cromatografa de reparto.
SOPORTES COMUNES
Fase DIRECTA: Tierra de diatomeas, Silica gel, Celulosa, Almidn
Fase REVERSA: Polvo de vidrio, Gomas, Acetil-Celulosa, Polimeros
FASES ESTACIONARIA / MVIL
DIRECTA
Agua n-butanol, isobutanol
Agua + cido benceno, tolueno, c-hexano, hexan
Agua + base/amortiguador cloroformo
Sol. Alcohlicas (MeOH, EtOH) Acetato de etilo
Metanol, Etanol, eter metlico, etilenglicol
Formamida Metil Etil Cetona
Glicoles (etileno, propileno, glicerol) Piridina
REVERSA
n-butanol agua
Octanol agua + cido
Cloroformo agua + base
Clorosinanos y siliconas agua + amortiguador
Aceite mineral sol. alcohlicas (MeOH, EtOH)
Parafina alcoholes (MeOH, EtOH), Formamida y
glicoles (etileno, propileno, glicerol)

Cromatografa de exclusin.
- Separacin de componentes de la muestra ocurre en
funcin del tamao molecular, se dividen en:

- Filtracin por gel.- soportes slidos constituidos por
mallas tridimensionales, polimricas. Separacin
ocurre por atrapamiento de partculas grandes, las
pequeas avanzan en funcin de su tamao.






Cromatografa de exclusin.
- Separacin de componentes de la muestra ocurre en
funcin del tamao molecular, se dividen en:

- Filtracin por gel.- soportes slidos constituidos por
mallas tridimensionales, polimricas. Separacin
ocurre por atrapamiento de partculas grandes, las
pequeas avanzan en funcin de su tamao.

- Tamiz molecular.- fase estacionaria en forma de una
red tridimensional de dimetro de poro especfico.
Separacin de partculas grandes avanzan primero
que molculas pequeas (mayor nmero de poros)







Cromatografa de intercambio inico.
- Separacin de componentes de la muestra ocurre en
funcin del tipo y magnitud de la carga elctrica, que
por atraccin de cargas opuestas se intercambian los
ines de la fase estacionaria (llamada resina), por la de
cada componente de la muestra.






Cromatografa de intercambio inico.
- Separacin de componentes de la muestra ocurre en
funcin del tipo y magnitud de la carga elctrica, que
por atraccin de cargas opuestas se intercambian los
ines de la fase estacionaria (llamada resina), por la de
cada componente de la muestra.
- Resinas de intercambio catinico.- tienen carga (-) y el in
intercambiable es de carga (+) o catin (H
+
/Na
+
).
- Naturales. zeolitas y arcilla (inorgnicas), turba y lignita (orgnicas)
- Sintticas. MgO, SiO2, Al2O3 (inorgnicas), R-SO
3
-
(resinas
catinicas)
- Resinas de intercambio aninico.- tienen carga (+) y el in
intercambiable es de carga (-) o anin (OH
-
).
- Naturales. Dolomita (inorgnicas), turba y lignita (orgnicas)
- Sintticas. Silicatos de metales pesados (inorgnicas), R-NR
3
+

(resinas aninicas)






Desarrollo cromatogrfico.
- Corresponde al mecanismo de separacin de los componentes de la
muestra al paso de la columna. Existen cuatro tcnica:

a. Elucin: adicin de la fase mvil provoca desplazamiento de los
componentes de la muestra a diferentes velocidades.
b. Elucin por gradiente: se realiza una variacin intencionada de las
condiciones del eluyente (fase mvil), usando dos o tres fases
mviles basndose en cambios de pH, fuerza ionica, constante
dielctrica o polaridad.






Desarrollo cromatogrfico.
- Corresponde al mecanismo de separacin de los componentes de la
muestra al paso de la columna. Existen cuatro tcnica:

a. Elucin: adicin de la fase mvil provoca desplazamiento de los
componentes de la muestra a diferentes velocidades.
b. Elucin por gradiente: se realiza una variacin intencionada de las
condiciones del eluyente (fase mvil), usando dos o tres fases
mviles basndose en cambios de pH, fuerza ionica, constante
dielctrica o polaridad.
c. Anlisis frontal: paso continuo de la muestra por la columna,
acumulndose los componentes y eluyendo por diferencias de
adsorcin o afinidad f. estacionaria/f. mvil.
d. Desplazamiento: fase mvil retenida por la fase estacionaria actua
como agente desplazante a travs de la columna de los
componentes de la muestra






Conceptos generales, cromatografia en columna.

- Carga de fase estacionaria en columna evitando agrietamientos.

- Corrimiento de la muestra por adicin de fase mvil en la columna
llamado ELUCIN.

- Colecta de la muestra a la salida de la columna se llama ELUIDO, en
funcin del volumen de la fase mvil adicionada o del tiempo de
elucin.






Conceptos generales, cromatografia laminar.

- Carga de fase estacionaria en forma de capa fina adherida a un
soporte

- La muestra se coloca a una altura especfica y se concentra con varias
aplicaciones y secado entre cada aplicacin.

- Corrimiento de la muestra se hace en cmaras de corrimiento, previa
saturacin de la fase estacionaria con la fase mvil.










Resolucin del mtodo.

- Capacidad de separacin de los componentes de la muestra =
RESOLUCIN R

- R = (tR2 tR1) / (w2 w1) = 2Dt / (w2 w1) donde:

- tR: tiempo de retencin
- w: anchura de la base del pico
- 1 y 2: componentes de la muestra.









Selectividad del mtodo.

- Medida de la preferencia que muestra la fase estacionaria por cada
componente sobre otro presente en la muestra a

a = K1 / K2 donde:

- K: coeficientes de distribucin
- 1: componente de la muestra que migra mas lentamente
- 2: componente de la muestra que migra mas rpido.









Eficacia del mtodo.
- Se expresa cuantitativamente mediante el nmero de platos tericos
N o la altura de ste H, donde L corresponde a la longitud de la
columna, es decir:

- H = L / N donde un plato terico: longitud de la columna donde existe
un equilibrio entre las dos fases del componente de la muestra.

- N = 16(V
R
/ W)
2
donde: V
R
: volumen de retencin, W: Ancho del pico
de elucin







Eficacia del mtodo.
- Se expresa cuantitativamente mediante el nmero de platos tericos
N o la altura de ste H, donde L corresponde a la longitud de la
columna, es decir:

- H = L / N donde un plato terico: longitud de la columna donde existe
un equilibrio entre las dos fases del componente de la muestra.

- N = 16(V
R
/ W)
2
donde: V
R
: volumen de retencin, W: Ancho del pico
de elucin

- V = tR * Vdsv donde: tR: tiempo de retencin del componente y Vdsv:
velocidad de flujo de la fase mvil.

- H: mide eficacia del mtodo, a menor valor mayor eficacia
- Como N es inversamente % a H, si aumenta N mejora resolucin.
- Como N es directamente % a L y su aumento implica un aumento de
N y por tanto mejor resolucin del sistema.









Valor de distribucin.

- Es la relacin que describe la cantidad de soluto (o componente) retenido por
una fase en relacin a otra fase y se expresa como coeficiente de distribucin
K. Depende de la T y P, independiente de la concentracin.

- K = C1 / C2 donde C: concentracin del soluto, 1 y 2 fase estacionaria y mvil
respectivamente.

- En reparto: coeficiente de reparto Kp = Cs / Cm donde S: fase estacionaria,
m: fase mvil.










Valor de distribucin.

- Es la relacin que describe la cantidad de soluto (o componente) retenido por
una fase en relacin a otra fase y se expresa como coeficiente de distribucin
K. Depende de la T y P, independiente de la concentracin.

- K = C1 / C2 donde C: concentracin del soluto, 1 y 2 fase estacionaria y mvil
respectivamente.

- En reparto: coeficiente de reparto Kp = Cs / Cm donde S: fase estacionaria,
m: fase mvil.

- En intercambio inico: coeficiente de distribucin Kd
- Kd = cantidad del in en la resina por g de resina seca / cantidad del in por mL de
solucin.

- En metodos laminares: Factor de retencin lineal Rf o Factor de retencin
radial Rd, entonces Rf (o Rd) = Dslt / Dslv donde Dslt: distancia recorrida por
el soluto (o componente), Dslv: distancia recorida por la fase movil

-