Patrimnio gentico

Agrupamento de Escolas n1 de Reguengos de Monsaraz

Ano Letivo 2013/ 2014
Biologia
Prof. Sandra Graa
O processo da PCR (Polymerase
Chain Reaction ou Polimerizao
por reaes em Cadeia) foi
primeiro descrito por cientistas da
Cetus Corporation, em 1983.
Kary Mullis (1) desenvolveu os
primeiros estudos acerca deste
processo, o que lhe valeu o Prmio
Nobel da Qumica, tendo-lhe sido
atribudo em 1994.
Ainda em 1989, a Hoffman La
Roche & Perkin-Elmer Corporation
patenteou o processo, por se ter
apercebido do potencial da
tecnologia do mesmo. Atualmente,
a Roche desenvolve esforos no
sentido do aprefeioamento da
tcnica.

1 Dr. Kary Mullis
Biologia Patrimnio Gentico PCR 12B
A PCR uma tcnica que permite a replicao in vitro de DNA de uma forma
muito rpida.
Esta tcnica permitiu avanos cientficos em todas as reas de investigao
gentica, bem como em reas de diagnstico/ seguimento de doentes.
A principal vantagem da PCR a amplificao exponencial de quantidades
mnimas de material gentico em poucas horas atravs de processos simples. O
prprio criador desta tcnica afirmou que seria apenas necessrio um tubo de
ensaio, uns quantos reagentes simples e uma fonte de calor.
A PCR baseia-se, ento, na capacidade da DNA polimerase (2) de sintetizar
novas cadeias de DNA complementares s cadeias-padro, ou seja, na sua
capacidade em replicar novas cadeias de DNA.
2 A ao da DNA polimerase
Biologia Patrimnio Gentico PCR 12B
Antes de se iniciar a reao de PCR propriamente dita, h que adicionar os reagentes
simples a que Mullis se referia num tubo (3) prprio para a mesma:
DNA extrado das clulas;
Primer 1: liga-se a qualquer extremidade do segmento a copiar. So ferramentas poderosas
no que toca cpia de sequncias de DNA especficas, pois a probabilidade de cometerem
erros muito baixa;
Primer 2: liga-se extremidade que ainda no possui o Primer 1, o que ocorre
graas complementariedade de bases;
Nucletidos: utilizados para criar milhes de cpias do DNA;
DNA polimerase: enzima que l o DNA e acrescenta nucletidos correspondentes
para criar as cpias, aguentando as temperaturas elevadas da reao de PCR;
Soluo-tampo: contm ies Mg2+, essencial atividade da polimerase. Impede
as variaes de pH.
O tubo depois acondicionado num termociclador (4), um aparelho que aquece
e arrefece o tubo a temperaturas especficas, no espao de uma hora. Estas
mudanas de temperatura so essenciais ao bom funcionamento da reao.
3/ 4 tubos de reao
PCR e termociclador
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Cada ciclo da reao de PCR constitudo por trs passos:
1. Desnaturao trmica a temperatura eleva-se a 95 C, separando a cadeia dupla de DNA,
formando, a partir dela, duas cadeias simples, diferentes mas complementares entre si.
2. Hibridizao ou Annealing o termociclador desce temperatura de 55 C. Os primers ligam-se
s sequncias-alvo, ou seja, o incio da sequncia de DNA alvo marcado pelos primers que se
hibridizam com a sequncia complementar.
3. Extenso ou Polimerizao aps a hibridizao dos primers s sequncias de DNA, a
temperatura eleva-se at 72 C e a enzima DNA polimerase replica a cadeia. O processo de
replicao iniciado numa zona onde esto ligados os primers, incorporando assim os nucletidos
complementares sequncia-alvo, formando uma nova cadeia em dupla hlice.
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Final do primeiro ciclo:
Aps o primeiro ciclo encontramos
duas novas cadeias idnticas
original;
A DNA polimerase no reconhece o
final da sequncia, pois a
extremidade 3 no est definida
pelo primer, havendo fragmentos de
diferentes tamanhos. As cadeias
cujos limites esto definidos pelos
primers denominam-se Amplicons.
So estes Amplicons que interessam,
ou seja, so eles que vo ser
recolhidos para futuras aplicaes;
Normalmente so realizados de 25 a
40 ciclos para cada reao, sendo a
taxa de replicao igual a 2
ciclos
.
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A sensibilidade extrema que caracteriza as reaes PCR torna possvel
trabalhar com uma amostra de material gentico muito pequena, mesmo que
contenha apenas restos de uma nica clula. Pode-se ainda obter uma
impresso digital do DNA da pessoa da qual a amostra proveio.
O DNA amplificado pelo PCR diferente na sequncia de um indivduo para
outro, pois o genoma de cada ser humano diferente.
A PCR encontra, ento, a sua principal aplicao em mtodos que necessitam
de uma quantidade de DNA maior que a disponvel, como por exemplo:
A investigao em biologia
O diagnstico de doenas
A medicina forense

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Estudos paleontolgicos;
Anlise de ligaes genticas;
Amplificao de sequncias a partir de material no qual o DNA est
gravemente degradado;
Amplificao de sequncias de DNA que sofreram mutaes;
Gnese de mutaes especficas ou recombinao de genes em estudo
Estes genes mutantes ou recombinados so bastante utilizados no estudo funcional
do genoma, da expresso gnica, da relao entre a estrutura-funo de protenas,
das interaes proticas, da engenharia protica e da evoluo in vitro de
enzimas.

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Anlise gentica;
Estudo da origem molecular de doenas;
Prognstico de alteraes na sequncia de DNA: deteo de delees/ inseres
determinadas pela gnese de produtos amplificados que apresentam alteraes
no seu tamanho;
Prognstico de mutaes pontuais (substituio de bases), sendo estas detetadas
pela ao de enzimas de restrio ou atravs do sequenciamento;
Diagnstico pr-natal ou pr-implantacional;
Diagnstico e prognstico de doenas de ordem gentica, como o cancro, atravs
do estudo de genes relacionados com as mesmas;
Deteo de agentes patognicos infecciosos (vrus da hepatite B e C, herpes,
vrus da rubola, HIV, clamdia, tuberculose, entre outros).





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Pequenas amostras de material gentico retiradas da cena de um crime so
amplificadas, atravs da PCR, para serem posteriormente analisadas pelo
mtodo do DNA fingerprint.
Com recurso a esta tcnica, at mesmo amostras antigas e j decompostas,
restos mortais de vtimas de incndios ou acidentes e corpos em decomposio
podem ser analisadas.
As reaes PCR so tambm teis, seguindo o mesmo mtodo do que na medicina
forense, na aplicao de testes de paternidade.




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Preparao dos
reagentes para
PCR
Termociclador
Desnaturao
trmica
Annealing
Polimerizao
Cadeia
amplificada
Eletroforese
Documentao
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Vantagens Limitaes
Simplicidade
Tcnica rpida, barata e segura
Sensibilidade
Rigor
Possibilidade de anlise de amostras
degradadas
Especificidade no necessrio isolar o DNA
que se quer amplificar, uma vez que a
especificidade da PCR dada pelos primers
necessrio conhecer a sequncia de DNA a
amplificar para que se possam sintetizar os
primers especficoss
Pode ocorrer a incorporao errnea de bases
durante a replicao, originando mutaes.
Sensibilidade
Limitada extenso da sequncia que possvel
amplificar (difcil aplicar a PCR a sequncias
superiores a 5 kb)
Sensibilidade contaminao com DNA
estranho, podendo ocorrer emparelhamento
entre os primers e este DNA (amplificao de
sequncias no pretendidas)
Biologia Patrimnio Gentico PCR 12B
Dias da Silva, A., Santos,
M.E., Fernandes
Mesquita, A., Baldaia, L.,
Flix, J.M. Terra
Universo de Vida
Biologia 12 ano (2013)
1 edio Porto: Porto
Editora
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ (consultado
em 27/3)
http://www.roche.pt/portugal/index.cfm/produtos/equipamen
tos-de-diagnostico/products/molecular-diag/intro-
pcr/(consultado em 27/3)
http://www.trabalhosfeitos.com/ensaios/Trabalho-De-
Gen%C3%A9tica-Sobre-Pcr/684700.html(consultado em 27/3)
http://www.trabalhosfeitos.com/ensaios/Rea%C3%A7%C3%A3o-De-
Polimeriza%C3%A7%C3%A3o-Em-Cadeia-
Pcr/470335.html(consultado em 27/3)
http://www.trabalhosfeitos.com/ensaios/Rea%C3%A7%C3%A3o-De-
Polimerase-Em-Cadeia/607942.html(consultado em 27/3)
http://www2.iq.usp.br/docente/goldberg/veterinaria2006/Aula_P
CRvet_2006.pdf(consultado em 27/3)
http://pt.slideshare.net/AdrianaDantas2/recombinao-genetica
(consultado em 28/3)
http://www.biomedicinapadrao.com/2011/10/reacao-em-cadeia-
da-polimerase-pcr.html (consultado em 28/3)
http://www.ufpe.br/biolmol/Genetica-
Medicina/ferramentas_gen_mol_hum.htm (consultado em 29/3)
http://nar.oxfordjournals.org/content/18/7/1687 /consultado em
29/3)


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