Biotecnología:

Técnicas en
BIOLOGÍA celular &
molecular
Técnicas en Biotecnología
◗ PCR
◗ Electrofóresis
◗ Transformación
◗ Clonación
◗ Southern Blot
◗ Northern Blot
◗ Western Blot
◗ Resumen
Polymerase Chain Reaction

(PCR)
¿Qué es PCR?
◗ La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un
método in vitro para amplificar seucencias
específicas de DNA.
◗ Comenzando con trazas o cantidades minutas de
una secuencia de DNA en particular, PCR genera
enzimáticamente millones y billones de copias
exactas de tal molécula permitiendo así analizar
genéticamente ínfimas cantidades de DNA.
◗ PCR fué inventada por Kary Mullis, en la
corporación Cetus, en 1983.
¿Como se hace un PCR?
◗ Se extrae la molécula de DNA a amplificar.
◗ Se coloca la muestra en la máquina de PCR.
◗ La máquina eleva la temperatura a cerca de 90oC para que las
hebras de DNA se separen.
◗ La temperatura baja a cerca de 55oC para permitir que
moléculas pre-diseñadas de primer se adhieran al DNA en
los sitios especificos.
¿Como se hace un PCR?
◗ La temperatura sube a 70oC para permitir que la enzima DNA
POLIMERASA extienda los primers sintetizando dos copias del
DNA; se completa así un ciclo.
◗ Un ciclo duplica la cantidad de DNA previa (función
exponencial.)
◗ En ciclos sucesivos se siguen amplificando las moléculas de
DNA sintetizadas.
◗ En una hora se pueden hacer millones de copias del DNA siendo
amplificado.
Denaturar DNA

Se aparean los primers

Se enlaza la DNA POL

Se extienden los primers

La amplificación procede
de modo exponencial
DNA GEL
¿Qué es electrofóresis?
◗ Electroforesis es la separación se sustancias
lograda al aplicar una corriente eléctrica.
◗ Depende de las diferentes velocidades a las
cuales las sustancias se mueven en el campo
eléctrico.
◗ En genética se utiliza mayormente para
separar fragmentos de DNA, RNA y
proteínas.
¿Qué se requiere para
hacer una electrofóresis?
◗ Un campo eléctrico (un power supply).
◗ Muestras de las sustancias que se quieren
separar (ejemplo: DNA, RNA o proteínas.)
◗ Un medio a través del cual se va a mover
las sustancias (ejemplo: una gel.)
◗ Un medio para determinar la localización
de las diferentes sustancias en el medio
(ejemplo: un tinte: ethidium bromide.)
Factores que determinan movilidad
◗ La velocidad a la cual migra la molécula es
proporcional a su carga y a la magnitud del campo
eléctrico.
◗ Las sustancias se separan porque sus moléculas
respectivas difieren en su carga y en la resistencia
a moverse a través del medio.
◗ Para moléculas de una forma similar, la resistencia
a moverse es proporcional al area superficial.
Principios de
Electroforesis en Gel
◗ DNA es una molécula negativamente cargada debido principalmente a los
grupos fosfatos. Si la molécula es colocada en un campo eléctrico migrará
desde el polo positivo (catódo) hasta el polo positivo (ánodo).

◗ Una gel, usualmente hecha de agarosa, sirve como la matriz o medio para
el movimiento de la molécula de DNA. La gel es un material semisólido
con poros de cierto tamaño.

◗ El DNA se corta en fragmentos de diferentes tamaños. Los fragmentos

más pequeños se moverán más facílmente a través del medio o gel que
los pedazos más grandes. Esto crea un patrón donde los fragmentos
quedan acomodados de acuerdo a sus tamaños respectivos ordenados de
mayor a menor desde el polo negativo al polo positivo.
 ¿Como se generan los fragmentos
de DNA?
◗ El DNA se corta utilizando enzimas de restricción.
• Ejemplos de dos diferentes enzimas de restricción:
• Eco RI, Hind III
◗ Enzimas de restricción cortan el DNA en secuencias
especificas llamadas restriction sites.
• Ejemplos para diferente sitios de restricción:
• Eco RI corta en G AATT C
• C TTAA G
• Hind III corta en A AGCT T
• T TCGA A
http://www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/flashfiles/GE.swf
Aparatos de Electróforesis
Aparato de Electroforesis
Aparato de Electroforesis con Gel
Foto de Electrofóresis
Electroforesis Vertical
                             

                                        
 ¿Como se hace una foto
de su DNA?
◗ Cada individuo tiene unas diferencias en las
secuencias de pareado de bases en su DNA.
◗ Las enzimas de restricción crean fragmentos de
restricción de diferentes tamaños en diferentes
individuos.
◗ Estos fragmentos de DNA crearán un patrón de
banda al exponerse a un campo eléctrico; este
patrón será especifico para cada individuo.
DNA GEL
Electrofóresis de distintas
muestras de DNA
Electrofóresis de distintas
muestras de DNA
Prueba de Paternidad
Transformación
◗ La introducción de una o más moléculas
exogenas de DNA en usualmente una célula
bacteriana.
◗ Expresión de DNA foraneo en una bacteria.
◗ Se utiliza pra introducir un plásmido
portando un fragmento de DNA exogeno en
una bacteria o célula de levadura.
Transformación
◗ Organismos utilizados usualmente en
experimentos de transformación:

• Escherichia coli
• Saccharomyces cerevisiae
• Vectores virales (fagos)
Transformación
◗ Antes de incorporar el DNA foráneo a una célula,
hay que clonar la molécula de DNA en cuestión:
• Clonación: purificación y aislamiento de
fragmentos individuales de DNA de una
molécula más grande o de una mezcla de
fragmentos de DNA mediante su incorporación
en un vector para formar DNA recombinante
que puede ser multiplicado en un huésped
bacterial.
Transformación
◗ Vectores sirven para transportar el
fragmento de DNA de interes.
• Plasmidos: moleculas de DNA circulares
autoreplicables.
• Bacteriofagos: virus que se replican en
bacterias independientemente del genoma.
• YAC’s: Yeast Artificial Chromosomes
• Viruses eucarióticos como SV40.
Clonación
◗ La muestra purificada de DNA a ser
clonada primero se fragmenta con enzimas
de restricción: endonucleasas que cortan el
DNA en secuencias especificas llamadas
palíndromes.
• Ejemplo de palíndrome: Madam, I am Adam.
Clonación
◗ Ambos, el DNA a ser clonado y el vector se cortan
con la misma enzima de restricción dejando
extremos cohesivos que se pueden unir por medio
de una ligasa.
◗ La mezcla resultante de recombinantes se utiliza
para transformar células bacterianas.
◗ Bacterias que reciban el vector se identifican por
medio de una reacción producida por algún gen
incorparado ya en el vector.
Clonación
◗ Genes utilizados para seleccionar colonias que
incorporen el vector:
• Genes resistentes a antibióticos como ampecilina,
tretraciclina y cloroamfenicol.
• Incorporar el fragmento de interes en medio de alguno de estos
genes, lo inactiva.
• Colonias que crezcan en medio conteniendo el antibiotico
especifico, incorporaron el vector con el gen de interes.
• Gen lacZ que codifica la enzima β-galactosidasa que
produce un color azul.
• Colonias azules no incorporaron el gen de interes.
Transformación
http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/mol
Luego que tenemos la bacteria
transformada, ésta se cultiva y
existen varias técnicas para
aislar ese DNA y purificarlo.
Southern Blot
◗ Una técnica desarrollada por Edward Southern en
1975.
◗ DNA denaturado es transferido de una gel de
agarosa en donde los fragmentos han sido
separados por electroforesis a una membrana de
nilón o nitrocelulosa colocada sobre la gel.
◗ El protocolo original envuelve el colocar toallas
de papel sobre la membrana para acelerar el paso
de buffer a través de la gel y directo a la
membrana por acción capilar.
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Southern Blot
Northern Blot
◗ Un método de transferir RNA denaturado a
una membrana de nitrocelulosa o de nilón
para utilizarse subsecuentemente en
experimentos de hibridación.
◗ RNA se somete a electroforesis antes de ser
transferido a la membrana por acción
capilar o por acción de un campo eléctrico
Northern Blot
◗ Un probe de DNA o RNA marcado
radioactivamente se hbiridiza al RNA
enlazado a la membrana para detectar
secuencias especificas.
◗ Técnica similar al Southern blot.
Northern Blot
Northern Blot
Northern Blot
Western Blot
◗ Un método para detectar una (o más)
proteínas específicas en una mezcla
compleja de proteínas tal como un extracto
celular.
◗ El procedimiento envuelve fraccionar la
mezcla de proteínas denaturandolas en una
gel de poliacrilamida.
Western Blot
◗ Se transfiere e inmobiliza la mezcla en una
membrana de nilón o neutrocelulosa.
◗ Se incuba la membrana con anticuerpos
producidos especificamente contra la proteína de
interes.
◗ El compleo antígeno—anticuerpo que se forma en
la membrana puede ser detectado aplicando un
segundo anticuerpo creado contra el primer
anticuerpo al cual una enzima ha sido
covalentemente enlazada.
Western Blot
◗ La enzima genera un producto insoluble
que se usa para detectar la presencia d ela
proteína de interes en la membrana.
◗ Ejemplo: quimoluminiscencia.
Western Blot
Western Blot
Western Blot