Biotecnologia

Paulo Marques
Processos biolgicos difcil de definir o comeo funcionam de
forma muito integrada.

CLULAS: Unidade fundamental da vida Menor parte de um ser vivo
capaz de desenvolver, de forma autnoma, as funes bsicas que
caracterizam a vida: Reproduo e Crescimento.

Organismos vivos unicelulares e pluricelulares

clulas assumem diferentes
formas e
se especializam em vrias
funes

diferenciao celular
CLULAS local de muitas reaes qumicas e
suas funes dependem das substncias
qumicas que produzem.

CLULAS ENTRE AS ESPCIES com muitas
diferenas, mas tambm com muitas
similaridades TODOS OS ORGANISMOS
DESCENDEM DE UM ANCESTRAL COMUM!

PROCARIONTES
EUCARIONTES

CONSTITUIO QUMICA DAS CLULAS: inorgnicos e
orgnicos


gua, sais min.
Carboidratos, lipdios

protenas e c. Nuclicos

PROTENAS E C. NUCLICOS IMPORTANTES PARA A BIOL.
MOLECULAR

CIDOS NUCLICOS DNA E RNA controlam de forma integrada a sntese
de protenas

O cdigo do DNA molculas de DNA e protenas so lineares

linear segundo a seqncia de nucleotdeos

cada 3 letras = 1 aminocido

SNTESE DE PROTENAS DNA RNAm Protena

Quando ocorre um erro - MUTAO

1. HISTRICO

O advento da Biologia Molecular

1940 - Bases da Biologia Molecular:
estudo da estrutura e funo das molculas
biolgicas.

1944 Avery, MacLeod e McCarty cido
desoxirribonuclico (DNA) continha a
informao gentica.



1952 Hershey e Chase - DNA tem a capacidade de
controlar as clulas : experincia com bacterifagos.

1950 Chargaff distribuio dos nucleotdeos
(identificados pelas bases nitrogenadas) possuia um padro:
quantidade de timina era igual a de adenina e guanina igual
a de citosina.

1953 utilizando os dados sobre a molcula de DNA
obtidos atravs de cristalografia de raios X por Rosalind
Franklin, James Watson e Francis Crick propuseram o
modelo dupla hlice do DNA: duas cadeias de nucleotdeos
enroladas em espiral e ligadas entre s pelas bases - como
o material gentico se duplica e produo do RNA , sntese
protica e controle da atividade celular).






1956 processos de autoduplicao
do DNA

1960 decifrao do cdigo
gentico dos aminocidos

1961 processo de transcrio do
RNA.

1962 processo de traduo do
RNA para sintetizar protenas.



Estrutura do DNA
Estrutura de Dupla
Hlice
(Watson e Crick -
1953)
Capacidade de
Replicao


A Molcula de DNA
Tipos de DNA
H pelo menos trs modelos de DNA :

Modelos A, B e Z

O DNA B de longe o mais frequente, mas o DNA Z
tamm encontrado na clula. Admite-se que o DNA
Z "silencioso", isto , no pode ser transcrito. A
transio B-Z seria, assim, um recurso para silenciar
grandes blocos de genes. A forma Z tambm a
nica que imunognica, isto , quando um paciente
tem anticorpos contra DNA, contra esta forma que
eles so produzidos.

DNA: A, B e Z. Nesta figura est bem visvel a fenda maior entre a volta verde de
cima e a vermelha de baixo e a menor, entre a vermelha de baixo e a verde da base,
no modelo B. Tambm fica claro que os dois modelos A e B so hlices destrgiras,
enquanto o Z levgiro. DNA Z no tem duas fendas ntidas, mas uma escancarada
e outra muito discreta.

CLASSES DE DNA
O DNA das clulas eucariontes apresenta trs fraes
caracterizadas pelo grau de repetio:
DNA Singular ou de Cpia nica
Constitui a maior parte do DNA no genoma. As
sequncias que codificam protenas (isto , a
poro codificadora dos genes) compreendem
apenas uma pequena proporo do DNA de cpia
nica. A maior parte do DNA de cpia nica
encontra-se em extenses curtas, entremeadas
com diversas famlias de DNA repetitivo .
Proporo do genoma: 75% .

DNA Repetitivo Disperso
Consiste em sequncias relacionadas que se
espalham por todo o genoma, em vez de
ficarem localizadas.
Os elementos repetidos dispersos mais
exatamente estudados pertencem famlia
Alu e famlia L1.
DNA Satlite
Envolve sequncias repetidas (em
tandem) agrupadas em um ou em
alguns locais, intercaladas com
sequncias de cpia nica ao longo do
cromossomo.
As famlias de DNA satlite variam
quanto localizao no genoma,
comprimento total da srie em tandem,
comprimento das unidades repetidas
que constituem a srie.
TRANSPOSONS
Transposons - molculas que copiam e colam
Transposons so pedaos de DNA que podem
copiar e inserirem-se em regies no-homlogas
de outros DNAs na mesma clula.

Transposons = Transposio


DNA: Processos de
replicao, Transcrio e
Traduo
Controle da expresso
gnica
Jacob e Monod criaram um modelo no qual o stio
promotor, associado a um outro stio chamado
operador, controlava a expresso de todos os genes
imediatamente abaixo, isto , 3, do promotor. A este
conjunto chamaram operon. Como os genes que
estudavam eram os responsveis pela sntese das
protenas que degradavam lactose, chamaram a este
arranjo de genes operon lac.

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

partir do conhecimento da molcula de DNA, os cientistas agora querem
administrar essa fbrica de protenas!!

DNA molcula relativamente simples e muito regular; varia s nas 4 bases
(com caract. qumicas muito semelhantes) e so macromolculas com as
mesmas propriedades qumicas.

pelo comportamento qumico impossvel separar uma molcula de DNA

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

O DNA extrado da clula com o gene de interesse cortado em fragmentos
menores de modo controlado - cada fragmento ligado em uma outra
molcula de DNA clula hospedeira

clula com a molcula hbrida, passa a copi-la, duplicando-a em cada diviso
celular com grande quantidade da molcula possvel localizar o gene.

Isolar o gene multiplic-lo e obter grande quantidade da protena

ENZIMAS DE RESTRIO (endonucleases)




2. Introduo Engenharia Gentica

Utilizando as enzimas de restrio
bacterianas, tornou-se possvel cortar dois DNAs
diferentes e, pela ao de enzimas ligases, unir os
segmentos resultantes e formar um DNA
recombinante - Tecnologia do DNA Recombinante
incio da Engenharia Gentica.

Assim, os cientistas tm desenvolvido tcnicas
que possibilitam transferir os genes de um tipo celular
para outro (por exemplo, de plantas e animais para as
bactrias).



Aplicaes comerciais: o futuro da
engenharia gentica considerado muito amplo,
sendo que j resolveu alguns dos maiores problemas
de pesquisa. Por exemplo, genes que codificam a
produo de compostos importantes, com produo
reduzida em seu tecido normal, podem ser
retirados de clulas animais ou vegetais e inseridos
na clula bacteriana- esta sintetiza em
quantidades ilimitadas os produtos codificados pelos
genes. Muitos exemplos de sua aplicao so
observados na medicina.

Outra aplicao importante a
transformao de plantas, animais e microrganismos
para a obteno de Transgnicos (OGM).







3. Importncia dos Microrganismos e das Enzimas na
Engenharia Gentica

As clulas animais e vegetais usualmente no podem
ser cultivadas para produo de compostos especficos
estas perdem a habilidade de sntese quando so isoladas e
cultivadas em laboratrio. Tambm , o cultivo de clulas de
tecido em laboratrio dispendioso e requer meios
complexos altamente enriquecidos.

Uso de microrganismos medicina: altamente
empregado, pois evita muitos dos problemas associados com
a obteno de compostos importantes (insulina, interferom,
hormnios, etc.). As bactrias que carregam os genes para
os mais diversos compostos, podem ser cultivadas
indefinidamente.




Por meio da introduo de genes estranhos em
microrganismos, possvel desenvolver cepas que oferecem novas
solues para problemas diversos, como poluio, escassez de
alimento e energia , controle de doenas e at mesmo terapia
gnica.

ENZIMAS: fundamental para a tecnologia do DNA
recombinante.

Endonucleases de restrio: apresentam papel fundamental,
clivando o DNA em seqncias especficas, gerando um
conjunto de fragmentos menores.
DNA ligase: os fragmentos separados para serem clonados
podem ser unidos a um vetor de clonagem apropriado usando
a DNA ligase.

Assim, o vetor recombinante introduzido numa clula
hospedeira que o clona, a medida que a clula realiza muitas
geraes de divises celulares.





Vetores de Clonagem

Plasmdios bacterifagos cosmdios - E. coli.

Plasmdios : molculas de DNA circulares que se
replicam separadamente do cromossomo
hospedeiro.
-Plasmdios bacterianos naturais 5.000
a 400.000 pares de bases.
-Plasmdios introduzidos nas clulas por
tcnicas de transformao

Utilizados para clonar segmentos de DNA at
15.000 pares de bases.



Construo de uma Bactria pela Engenharia
Gentica

Obteno do gene do organismo doador ou, em
alguns casos, pode ser sintetizados em
laboratrio pr nucleotdeos artificiais.
DNA plasmidial (ou outro vetor de clonagem)
isolado para servir como carreador de
determinado gene.
O DNA doador e o plasmidial so tratados
com a mesma enzima, uma endonuclease de
restrio, que cliva o DNA, formando fitas
simples com terminais complementares
(terminais coesivos). Esses so capazes de
ligar-se a outros fragmentos de DNA que
apresentam o mesmo terminal complementar
das fitas simples.


O terminal coesivo de um fragmento de
DNA doador liga-se com o terminal coesivo
do DNA plamidial atravs da DNA ligase
plasmdio com o fragmento do DNA
doador.
O plasmdio adicionado a uma suspenso
de bactrias receptoras transformao.
As bactrias geneticamente construdas
so propagadas em grande quantidade e o
produto (protena) codificado pelo gene
transferido extrado da cultura e
purificado. Ou outro caminho colocar
esta bactria transformada com outro
tecido e fazer a transferncia do gene.


Isolamento e amplificao
de plasmdios














Bacterifago : clonagem de segmentos de
DNA maiores. Bacterifago 48.502 pares
de bases.
Clonagem do DNA no Bacterifago baseado
em duas carcatersticas-chave do genoma do
genoma do : a) um tero do genoma no
essencial e pode ser substitudo pelo DNA
estranho b) o DNA ser empacotado em
partculas do fago infecciosas, apenas se
possurem entre 40.000 e 50.000 pares de
bases de comprimento.

Utilizados para clonar fragmentos de DNA at
23.000 pares de bases.




Cosmdios : plasmdios recombinantes com caractersticas
teis tanto dos plasmdios quanto do bacterifago .
Cosmdios so molculas de DNA circulares pequenas
(5.000 a 7.000 pares de bases), que contm:

a) uma origem plasmidial de replicao;
b) um ou mais marcadores de seleo;
c) um certo nmero de stios nicos de restrio onde o
DNA estranho pode ser inserido e;
d) um stio cos (seqncia de DNA do bacterifago ).

Utilizados para clonar fragmentos de DNA at 45.000
pares de bases.



PORQUE CONSTRUIR UMA MOLCULA DE DNA
RECOMBINANTE?
- ESTUDO DA ESTRUTURA DOS GENES
- DIAGNSTICO CLNICO
- TERAPIA GNICA
- MELHORAMENTO ANIMAL E VEGETAL
- OBTENO DE GRANDES QUANTIDADES
DE PROTENAS RARAS.
- CONSTRUO DE BIBLIOTECAS DE
GENES

Vetores de clonagem
Isolamento de um gene
especfico
Como exemplo gene humano
Quanto maior o nmero de fragmentos ou
clones produzidos, mais difcil ser encontrar o
clone com o gene de interesse.



BANCOS GENMICOS DE ORGANISMOS
COMPLEXOS (P. EX. HOMEM), DEVEM SER
CONSTRUDOS COM FRAGMENTOS DE DNA
NO MUITO PEQUENOS.

BANCO CROMOSSMICO - Banco genmico
para cada cromossomo.

CROMOSSOMOS - so isolados por
fluorescncia.


Seqenciamento de DNA: Identificao da
Seqncia de Nucleotdeos que compem a
molcula de DNA
Molcula de DNA Informao Gentica
DNA- Polmero, cujas
unidades so os
nucleotdeos. Cada
nucleotdeo consiste de
um acar, uma base
nitrogenada e um grupo
fosfato


6. Problemas Envolvidos na Clonagem do Gene

Endonucleases de restrio podem cortar e destruir
os genes a serem clonados. Tambm mais que um gene
pode estar envolvido na expresso de uma
caracterstica.

Insero incorreta do gene doador no plasmdio vetor
resultando na falha da bactria em expressar o
gene.

A protena sintetizada pode estar dentro da clula
como agregados grandes e insolveis ocorrem
dificuldades no isolamento da protena.

Pode ocorrer sntese em excesso do produto do gene
s vezes pode ser letal para a bactria.

DNA recombinante
Uso de enzimas bacterianas
conhecidas como enzimas de
restrio;
As enzimas de restrio so
altamente especficas;
Corta o DNA apenas nos locais onde
existem certas seqncias de bases
nitrogenadas.
Enzimas de restrio
Importncia:

Foi empregada no Projeto Genoma
Humano;
empregado em laboratrios de
Gentica molecular
P.G.H.
Objetivos:

Mapeamento gentico;
Determinar a seqncia de bases de
todos os genes de nossa espcie.

Curiosidade: O nmero total de genes
apresentado pelo projeto foi de 30 a
31 mil
P.G.H.
Perspectivas:

Cura de doenas por substituio de
genes anormais;
Questo da Biotica (uso para o bem
comum e no por interesses
individuais).
Eletroforese
uma tcnica que separa molculas
DNA, RNA e protenas de acordo com
seu tamanho e carga eltrica;

Velocidade de migrao atravs de
um suporte de material gelatinoso
(gel de agarose), submetido a um
campo eltrico.
DNA tem carga geral
negativa;
Migrao inversamente
proporcional ao tamanho
Reao em Cadeia da Polimerase
(PCR)
uma tcnica para amplificar
pedaos de DNA por meio de uma
reao em cadeia utilizando enzimas

Muitos tcnicas de manipulao de
DNA requerem muita amostra de
DNA e que este esteja puro
PCR
Algumas aplicaes:

Diagnstico de doenas genticas;
Deteco de infeces;
Monitorao de terapia contra o
cncer;
Sequenciamento de DNA;
Fingerprinting forense.
Nanotecnologia
a utilizao de partculas que so
medidos na ordem de nanmetros
em vrias cincias;
Richard Feynman.
Nanobiotecnologia
Aplicao na Biologia;
Perspectivas:

superfcies nanofabricadas com
padres estruturais poderiam fazer
crescer artificialmente ilhas
pancreticas e reverter os efeitos da
diabetes;
Nanobiotecnologia
nanodispositivos poderiam funcionar
como kits de reparo de neurnios
para pessoas com mal de Parkinson
ou doena de Alzheimer;
destruir vrus ou clulas cancerosas;
descoberta acelerada de drogas, com
menor custo