1

Endonucleasas de Restriccin
Enzimas que tienen la capacidad de cortar DNA doble cadena en una
secuencia especfica o restringida

Extradas y clonadas de bacterias:



Nombre de ER: segn la bacteria a partir de la cual fue aislada
Ejemplo: EcoRI
Eco: Gnero y especie: Escherichia coli
R: Cepa RY12
I: primer ER aislada de este organismo
Forman parte de un sistema de Restriccin-Modificacin, actuando
como un sistema de defensa contra patgeno, protegindolas del
ataque de DNA forneo (ej.: bacterifago).
R: endonucleasa (corta DNA doble cadena rompiendo uniones
fosfodister)
M: modifica al DNA por metilacin (metilasa)
Es decir, cada enzima de restriccin tiene una metilasa asociada.
Ambas enzimas reconocen la misma secuencia de bases. La metilasa
metila una base determinada siempre dentro de la secuencia de
reconocimiento, mientras que la endonucleasa puede cortar dentro
de la secuencia de reconocimiento o fuera de ella, dependiendo del
tipo de enzima.
La metilacin en las dos hebras del DNA evita que la Enzima de
Restriccin pueda cortar la molcula de DNA. Este mecanismo es
empleado por las bacterias para proteger a su propio DNA genmico
y plasmdico del ataque de sus propias Enzimas.
2
El sistema R-M funciona como un sistema inmune
Mecanismo para resistir el ataque viral
Permite a la bacteria distinguir entre DNA propio y DNA forneo:
las ER digieren al DNA forneo no metilado
y protegen DNA propio por metilacin
Ejemplo: (especfico para las de Tipo II)
1) Ambas cadenas metiladas no hay ni metilacin ni restriccin
3) Ninguna cadena metilada no hay metilacin, s restriccin
M.EcoRI
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH
3
CH
3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH
3
CH
3
R.EcoRI
2) Slo una cadena metilada hay metilacin y no restriccin
M.EcoRI
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH
3
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
CH
3
CH
3
R.EcoRI
5---- G AATTC ---- 3
3---- CTTAA G ---- 5
M.EcoRI
5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
R.EcoRI
3
Por qu el sistema R-M funciona como un sistema inmune?
No hay lisis
Caso 2
Lisis
Caso 3
No hay lisis
Bacteria EcoRI
+
HindIII
-
Bacteria EcoRI
-
HindIII
+
Bacteria EcoRI
+
HindIII
-
Caso 1
HindIII
DNA del fago con las
secuencias de
reconocimiento de
ambas ER
EcoRI
5---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3
3---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5
CH
3
CH
3
HindIII
DNA del fago con las
secuencias de
reconocimiento de
ambas ER
EcoRI
5---- GAATTC --------------- AAGCTT---- 3
3---- CTTAAG ----------------TTCGAA---- 5
CH
3
CH
3
4
DNA metilasas o metiltransferasas:
Transferencia de un grupo metilo desde una molcula donante
(SAM) a una A y C:





No requieren Mg
2+
como cofactor

Eucariotas: asociadas a la inactivacin gnica: metilaciones en la
posicin C5 de las C en islas CpG

Procariotas: participan principalmente del sistema R-M
En las cepas de E.coli de laboratorio existen 3 DNA-MT:
Sistema hsd: AAC(N6)GTGC and GCAC(N6)GTT
Dam metilasa: GATC
Dcm metilasa: CCAGG y CCTGG

DNA plasmdico aislado de cepas E.coli Dam+ son resistentes al
corte por MboI (GATC)

Si se quiere clivar una molcula recombinanate con ER sensibles a
la metilacin por estas MT, la misma debe ser amplificada y aislada
a partir de cepas Dam- y Dcm-

5
Composicin de las subunidades
Especificidad de la secuencia de reconocimiento
Sitio de clivaje
Requerimiento de cofactores
Sistema de Restriccin metilasa dependiente
Endonucleasas que clivan DNA doble cadena cuando est doblemente
metilado o hemimetilado

En E.coli existen tres sistemas:
MrcA:
m5
CG

MrcBC: Pu
m5
CG

Mrr:
m6
A

Clasificacin de ER
6
ER Tipo I Tipo II Tipo IIs Tipo III
Estructura
proteica
Bifuncional, 3
subunidades
Unifuncional,
endonucleasa y
metilasa en
enzimas
separadas
Unifuncional,
endonucleasa y
metilasa en
enzimas
separadas

Bifuncional, 2
subunidades
distintas
Sitio de
reconocimiento
Asimtrico y
bipartito

Secuencia
palindrmica
(simtrica),
4-6 pb (tb de
8pb)

Asimtrico y
continuo
Asimtrico,
5-7 pb.
R: secuencia
duplicada en
direcciones
opuestos
Sitio de clivaje No especfico
1000pb del
sitio de
reconocimiento
En el mismo sitio
de
reconocimiento
o adyacente a
este
A distancias
fijas del sitio
de
reconocimiento
(fuera del
mismo)
24-26 pb ro
abajo del sitio
de
reconocimiento
Requerimientos ATP para
moverse del
sitio de
reconocimiento
al de clivaje,
Mg2+, SAM
No ATP
Mg2+, (la M
requiere SAM)
Mg2+, (la M
requiere SAM)
No ATP
ATP para
moverse del
sitio de
reconocimiento
al de clivaje,
Mg2+, SAM
Ejemplo EcoKI
AACN
6
GTGC
TTGN
6
CACG
EcoRI AwlI EcoP15
CAGCAG(N)CTGCTG
GTCGTC(N)GACGAC
Uso en biologa
molecular
No generan
fragmentos de
tamao
definido
Generan
fragmentos de
tamao definido,
se usan en el
laboratorio!!!
Generan
fragmentos de
tamao definido
No generan
fragmentos de
tamao definido
Clasificacin de ER
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Tipo II (las que se emplean en el laboratorio)
Las secuencias de reconocimiento pueden ser:

sec palindrmicas y continuas (reconocidas por homodmeros)
Ejemplo: EcoRI



Secuencias simtricas y discontinuas (reconocidas por homodmeros)
Ejemplo: BglI



sec asimtricas y continuas (reconocidas por heterodmeros)
Ejemplo: BbvCI




Cdigo de una letra
N = A or C or G or T
8
Extremos:
Romos:



Cohesivos:
5 protruyente




3 protruyente





5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
5---- G AATTC ---- 3
3---- CTTAA G ---- 5
EcoRI
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5
5----CCC GGG ---- 3
3----GGG CCC ---- 5
SmaI
5---- CTGCAG ---- 3
3---- GACGTC ---- 5
5----CTGCA G ---- 3
3----G ACGTC ---- 5
PstI
La ligacin de extremos cohesivos requiere complementariedad de
secuencia
La ligacin de extremos romos no requiere de secuencias
complementarias: dos extremos romos cualquiera pueden ser unidos por
la DNA ligasa.
La eficiencia de ligacin de extremos cohesivos es mayor que la de
extremos romos.
9
Isoesquizmeros:
Son distintas ER que reconocen la misma secuencia, generalmente con
distintas especificidades. Pueden generar:
los mismos extremos: Acc65I y KpnI




distintos extremos:








ER que reconocen distintas secuencias, pero dejan los mismos
extremos:




5----GGTACC ---- 3
3----CCATGG ---- 5
5----G GTACC ---- 3
3----CCATG G ---- 5
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5
5----CCCGGG ---- 3
3----GGGCCC ---- 5
5----CCC GGG ---- 3
3----GGG CCC ---- 5
5----C CCGGG ---- 3
3----GGGCC C ---- 5
XmaI
SmaI
5----GGATCC ---- 3
3----CCTAGG ---- 5
5----AGATCT ---- 3
3----TCTAGA ---- 5
5----G GATCC ---- 3
3----CCTAG G ---- 5
5----A GATCT ---- 3
3----TCTAG A ---- 5
BglII
BamHI
10
Cmo generar nuevas secuencias de corte
1- Corte, filling in/trimming back, religacin:
Filling in (5 protruyente)









Trimming back (3protruyente)




5---- GAATTC ---- 3
3---- CTTAAG ---- 5
5---- G AATTC ---- 3
3---- CTTAA G ---- 5
EcoRI
fill in (con DNApol +
dNTPs)
5---- GAATT AATTC ---- 3
3---- CTTAA TTAAG ---- 5
5---- GAATTAATTC ---- 3
3---- CTTAATTAAG ---- 5
ligasa
XmnI (GAANN/NNTTC)

5---- CTGCAG ---- 3
3---- GACGTC ---- 5
5----CTGCA G ---- 3
3----G ACGTC ---- 5
PstI
3-5exonucleasa
5----C G ---- 3
3----G C ---- 5
Ligados entre s o a otros
fragmentos con extremos romos
11
3- Ligacin de extremos romos:








2- Ligacin de extremos complementarios:




5----G GATCC ---- 3
3----CCTAG G ---- 5
5----A GATCT ---- 3
3----TCTAG A ---- 5
BglII
BamHI
Ligasa
MboI (/GATC)
5----AGATCC ---- 3
3----TCTAGG ---- 5
5----GGATCT---- 3
3----CCTAGA ---- 5
5----AG CT---- 3
3----TC GA---- 5
AluI
5----GAT ATC---- 3
3----CTA TAG---- 5
EcoRV
Ligasa
5----AGATC---- 3
3----TCTAG---- 5
5----GATCT---- 3
3----CTAGA---- 5
MboI (/GATC)
12
Usos en el laboratorio
Generar fragmentos de DNA de tamao definido para:
generar molculas recombinantes: clonado

HindIII
NcoI
NcoI
HindIII
Fragmento
amplificado
Yep51
p
p
+
Ligacin
Digestin con
ER
Screening de transformantes por ER
Digestin
con
HindIII
Calle1: markers (23.13, 9.42, 6.55,
4.36, 2.32, 2.07 y 0.56 kpb)
Calle2: vector digerido sin inserto
Calle3: vector con inserto digerido
(digestin completa)
13
En el laboratorio: reaccin de digestin con ER
1) Eleccin de la ER
Extremos, secuencia y frecuencia de corte, y la cepa


2) Reaccin de digestin
3) Mezcla: pipetear + spin-down
4) T 37C ( 50-65C)
5) tiempo: 1 hs
(compromiso entre tiempo y cantidad de enzima)
Tiempos muy prolongados: cortes inespecficos: Actividad STAR
6) Frenar de la reaccin:
calor o shock trmico (65-80C por 20)
fenol/cloroformo y posterior precipitacin del DNA

DNA (1 g) libre de contaminantes
Buffer de reaccin (1X)
(viene 10X)
pH (Tris-Cl)
sales (NaCl o KCl) =Fi
cofactores (Mg2+)
BSA

ER (1 l= 10U)
mantener en fro
ltima en ser agregada
glicerol < 5% v/v
1UE: cantidad de enzima que corta
completamente 1 g de DNA del fago
lambda en un volumen de 50 l en 1 hs
usando el buffer correspondiente
H
2
O csp 50L
14
Actividad STAR:
Algunas enzimas (en condiciones de reaccin que no son las ptimas) pueden
producir cortes en secuencias que son similares a sus secuencias de corte.

Ejemplo:
EcoRI en condiciones ptimas cliva:
5 G/AATTC 3

en condiciones no ptimas puede clivar:
5 N/AATTN 3

Condiciones que contribuyen a la actividad STAR

1- glicerol [>5% v/v]
2- alta UE/ g of DNA (>100 UE/g)
3- baja Fi [<25 mM]
4- alto pH [>pH 8.0]
5- sv orgnicos (DMSO, etanol)
6- sustitucin de Mg++ por otros cationes divalentes (Mn++, Cu++, Co++, Zn++)
7- tiempo de incubacin mayor al ptimo
8- fragmento de DNA amplificado por PCR, sin previa purificacin del mismo

Cmo inhibir la actividad STAR

1- mn UE (digestin completa)
2- DNA libre de contaminantes
3- aumentar Fi 100-150 mM
4- pH 7.0.
5- Mg++


15
En los catlogos se describen las distintas caractersticas de cada
enzima, como las siguientes:
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Secuencia a digerir:
Existen programas en internet en los cuales uno puede introducir la
secuencia de bases completa simple cadena y obtener el MAPA DE
RESTRICCIN. Ejemplo: Neb cutter V2.0
Secuencia del gen BCY1:







Z
No presenta las secuencias de corte para HindIII ni NcoI
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Nco
I
Digestin doble
Digerir un mismo fragmento de DNA con dos ER distintas. Por
ejemplo: hacer clonado direccional

evitar tener que precipitar al DNA dos veces, lo cual podra resultar
en la prdida de masa de DNA
ahorrar tiempo

A tener en cuenta:

En el vector:
Las secuencias de reconocimiento de las ER a emplear no debern
solaparse, y debern estar a una determinada distancia en pb cuando
se realiza una digestin doble.












En el fragmento: la distancia del sitio de corte al extremo del
fragmento









Primers:
Forward: 5' GACCATGGTATCTTCTTTGCCCAAGG 3'
Reverse: 5' GGAAGCTTTTAATGTCTTGTAGGAT 3'


NcoI
HindIII
18
Digestin doble

Buffer de reaccin compatible











Incompatibilidad digestin secuencial :

a) correccin del buffer o T

b) precipitacin del DNA

Tabla de doble entrada: