Anticuerpos

Prof. Manzur Hassanhi

Plan de las clases
Anticuerpos
1. Estructura
2. Funcin
3. Complejo receptor, correceptores y coestimuladores de
la clula B madura
4. Uso de los anticuerpos en el laboratorio:
inmunodiagnstico
5. Uso clnico de los anticuerpos: inmunoterapia
6. Produccin de anticuerpos para uso clnico y
diagnstico

Forma secretada
Forma de membrana (BCR)
Ag.
I. Anticuerpos
Ag.
Ig Ab
Clula plasmtica
Anticuerpos y Patologa
1. Su falta provoca inmunodeficiencia.
Incluso deficiencias de algun isotipo (IgA) o
deficits cuantitativos pueden comprometer la
inmunocompetencia.
2. La presencia de autoanticuerpos de isotipo IgG
contribuye a la autoinmunidad.
3. La presencia de IgE alergenoespecfica
contribuye a las enfermedades alrgicas.
1. Estructura de los anticuerpos
Caractersticas estructurales comunes
2H + 2L
Dominios inmunoglobulina
Dominios variables y constantes
Caractersticas diferenciales
Variacin continua (clonal):
Regiones variables
Combinacin VDJ

Variacin discreta :
Cadena pesada
Clases Isotipos, subtipos o subclases:
Cadena ligera. Tipos:

Cadenas
pesadas
Cadenas
ligeras
Sitios de unin
al antgeno
Regin
Variable
Especificidad
Regin
Constante
Funcin
Caractersticas estructurales
comunes de los anticuerpos

Forma monomrica: 2 cadenas
ligeras (L) idnticas y 2 pesadas (H)
tambin idnticas
Uniones disulfuro:
H-L:
H-H:
Cadenas estn constituidas por
dominios inmunoglobulina
Dominio de inmunoglobulina
110 aa
Nomenclatura de los dominios de
inmunoglobulina
Dominios
variables
Dominios
constantes
Variacin de los anticuerpos
Diversidad 10
9
molculas de
anticuerpos diferentes en cada
individuo,
La diversidad en la secuencia esta
confinada a los dominios
aminoterminales (dominios
variables) de las cadenas pesadas y
ligeras.

Variacin discreta (categorizable):
Cadena pesada clases e Isotipos
a,d, e, g1,g2,g3,g4
cadena ligera. Tipos: y . 4 isotipos
Variacin continua (no categorizable):
Nmero de clones muy elevado
Diversidad de la regin variable 10
7
a 10
9

molculas diferentes con secuencias nicas
en sus sitios de unin al antgeno.

Caractersticas estructurales
diferenciales:
Variacin gnica (en distintos loci)
En funcin de cadena pesada, clases: aIgA, dIgD, eIgE, IgM, gIgG.
Isotipos, subtipos o subclases: 95 % de identidad productos de
segmentos gnicos diferentes.
Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4.por orden decreciente de concentracin en
suero.
Ig A1 suero, Ig A2 secreciones
Subtipo determina funcin biolgica
cadena ligera. Tipos: y . 4 isotipos
Variacin discreta
Distribucin de los isotipos
Distribucin
1. Superficie de clulas
productoras (todos)
2. Plasma (IgG IgA IgMpent) y
fluido intersticial (IgG)
3. Unidos a receptores de alta
afinidad en la superficie de
otras clulas (IgE)
4. En lquidos secretados IgA
dim

Variacin allica (alelos alternativos)

Alotipos: Productos de alelos alternativos
Alotipo A2m: A2m(1) A2m(2), locus A2m
AlotipoGm: locus G1m 11 alotipos, locus
G2m 1 alotipo, locus G3m 11 alotipos
AlotipoKm 3 alotipos

FR1
FR2
FR3
FR4
HVR1
HVR2
HVR3
V
a
r
i
a
b
i
l
i
t
y

I
n
d
e
x

25 75
50
100
Amino acid residue
150
100
50
0
Regiones variables (HVR) y regiones
armazn
Las HVR (high variable regions) tambin
se denominan regiones determinantes de
la complementariedad (CDRs) porque
forman la superficie de unin al antgeno
Entre ellas se disponen regiones armazn
de secuencia ms conservada.

Segmentos hipervariables
Cadena ligera
Tipos y
Proporciones 2/3 , 1/3 ,
No existen diferencias funcionales,
Contienen un dominio variable aminoterminal y otro
constante carboxiterminal.
3 segmentos hipervariables o CDRs. El ms variable es el
CDR3,
Regiones armazn: Ciertos aminocidos estn altamente
conservados,
Los dominios constantes son idnticos en las molculas de
cada tipo y similares entre los dos tipos de cadena L
Se usan como indicadores clonalidad en tumores
Cadena pesada
Contienen un dominio variable aminoterminal (regin
V) y varios constantes (region C).
1. Regin V formada por 3 segmentos hipervariables o
CDRs. El ms variable es el CDR3.
2. Regin bisagra entre C
H
1 y C
H
2 tamao desde 10 aa ( a1,
a2, g1, g2, y g 4) hasta 60 aa en (g4 y d)
funcion: posibilidad de variar la disposicin relativa y la
distancia entre los dos centros de unin al antigeno.
3. La regin constante es distinta en cada tipo o isotipo,
pero es invariante para las cadenas de un mismo isotipo.
4 dominios en las regiones constantes de Ig M e Ig E,
3 en Ig A, Ig D, Ig G.

Formas de expresin
Difieren en la secuencia de aminocidos del ltimo
dominio carboxiterminal de la cadena pesada.
Forma secretada
Forma de membrana
Asociacin de las cadenas.
Asociacin H-L
Asociacin H-H
Piezas de cola
Secuencias adicionales no globulares en el extremo
carboxiterminal del ultimo dominio de la cadena
pesada. Se asocian a cadena J y participan en
polimerizacin (IgM) y transporte (IgA)
C4
J
Chain
Antgenos
Antgeno:
Sustancia que se une especficamente a un
anticuerpo.
Inmungeno:
Sustancias capaces de generar respuestas inmunes.
Determinante antignico o eptopo
Porcin de una molcula que es reconocida por el anticuerpo
Tipos:
Determinantes conformacionales o discontinuos: Formados por aa
de porciones separadas en la secuencia primaria de la protena pero
que estn juntos yuxtapuestos en la estructura tridimensional.
Determinantes lineales: 6 aa de longitud, formados por aa
correlativos en la estructura primaria, la mayora son inaccesibles en
la conformacin nativa y slo aparecen cuando la protena sufre
proteolisis o desnaturalizacin.

Sitios de Unin antgeno-anticuerpo
Unin no covalente, es reversible pero de alta afinidad.
Localizacin: Regiones hipervariables del fragmento Fab.
1.- Mayor variacin entre distintos anticuerpos.
2.-Los cambios en su secuencia alteran la especificidad de
unin.
3.- Forman lazos extendidos expuestos en la superficie del
anticuerpo (estudios de difraccin de rayos X).
4.- Los residuos aminocidos de las regiones hipervariables
estn en contacto con el antgeno unido, sobre todo la regin
CDR3, (la ms variable).

Fuerzas que participan en interaccin
Antgeno-Anticuerpo
Caracterizacin de la unin al
antgeno Supuestos:
Antgeno con un solo determinante por molcula,
Todos los anticuerpos presentes especficos frente a l, temperatura
y condiciones de disolucin controladas.
Constante de disociacin (K
d
): La concentracin Molar
de ag. a la que la mitad de las molculas de Ab esten unidos
a el y la otra mitad libre. para los Ab es de 10
-7
a 10
-11
.
Afinidad (inverso de la constante de disociacin): Mide la
intensidad de la unin de un ag monovalente a un Ab con un
solo lugar de unin.
Caracterizacin de la unin al
antigeno en condiciones reales
Multivalencia, los antgenos suelen tener ms de un
determinante (antgenos multivalentes), los anticuerpos
tienen ms de un sitio de unin (de 2 a 10).
La afinidad de una unin multicntrica es mucho
mayor que la que resultara de la suma de las afinidades
de cada uno de los lugares de unin implicados.
Avidez: Mide la intensidad global de la unin de un
anticuerpo a un antgeno.
2. Funciones de las distintas regiones
1.-El sitio de unin al antgeno
esta formado por segmentos de
las regiones V
L
y V
H

2.-La porcin Fc. activa las
funciones efectoras que
dependen principalmente del
isotipo de la cadena pesada.
Unin a
FcR
Unin
complemento
Transferencia
placentaria
Unin al
antgeno
Funciones de las distintas regiones
3.- La regin bisagra determina como una molcula
de anticuerpo puede interaccionar
simultneamente con dos molculas de antgeno.

IgG1, IgG2 and IgG4 IgG3
Flexibilidad de la regin
bisagra
Funciones de los anticuerpos
1. Son desencadenadas por la unin al antgeno.
2. Son muy variadas desencadenan mecanismos
efectores diversos.
3. Dependen del isotipo del anticuerpo.
Neutralizacin del antgeno

Anticuerpos secretados de cualquier isotipo:
Impiden la accin toxica o infecciosa de las
molculas a las que se unen.

Funciones isotipo especficas
1. Permiten distintos tipos de respuestas contra cada
tipo de patgeno.
2. Variedad de la regin variable permite reconocer
distintos antgenos. Los distintos isotipos, permiten
atacar a un patgeno por distintos mecanismos.
Distintos isotipos con una misma especificidad
antignica activan diferentes funciones efectoras.
3. La seleccin del mecanismo mas eficaz permite
adaptar la respuesta inmune se adapte al patgeno
portador del antgeno.
Diferentes isotipos y subtipos de Ig realizan funciones
diferentes
Funciones de los distintos isotipos
+
Distribucin isotipos
1250mg/dl
Ig G
1
Ig G
2
Ig G
3
Ig G
4


250 mg/dl
IgA
1
110mg/dl
Ig M
Ig A
2
Ig G
1
IgE
Ig E
Ig A
2
Ig E
Ig G
1
Ig G,
IgA1,
Ig M
Aire
Luz
intestinal
Activacin del complemento por
Ig M e Ig G.
C1q se une a la regin Fc (Cg2, C3) de
inmunoglobulinas unidas a antgenos.
De las IgG humanas IgG3 activa eficientemente
el complemento, IgG1 algo menos, IgG2
pobremente, IgG4 nada.
Aumento de la fagocitosis,
opsonizacin por IgG.
Las partculas antignicas son recubiertas
por anticuerpos cuyas regiones Fc son a su
vez reconocidas por receptores especficos
de los neutrfilos y los fagocitos
mononucleares (FcgRI; FcgRII, FcRIII)
estimulando la fagocitosis de las partculas


Citotoxicidad dependiente de
anticuerpo (ADCC)
Los linfocitos citotxicos expresan receptores de
baja afinidad para FcIgG (FcgRIII=CD16) que solo
se unen a IgG agregada en superficies reconocidas
por los anticuerpos.

ADCC por los Eosinfilos
Tienen receptores para regiones Fc de IgA e IgE y
exocitan grnulos con contenido letal para parsitos y
helmintos insensibles a otras clulas efectoras.
Hipersensibilidad inmediata
desencadenada por Ig E
Los mastocitos y los basfilos expresan receptores
para FcIgE (FceRI) de alta afinidad ocupados por
monmeros en ausencia del antgeno
Inmunidad en las mucosas mediada
por la Ig A.
La IgA es transportada a travs
de las barreras mucosas y es
secretada a la luz intestinal
donde neutraliza posibles
patgenos o toxinas derivadas
de ellos.

Transferencia de inmunidad pasiva
al feto y al neonato por la IgG.
Los mamferos durante la vida fetal o recin nacidos
no son capaces de responder eficazmente a los
microbios.
Las IgG maternas son capaces de atravesar la
placenta y pasar ala sangre del feto
Las madres en periodo de lactancia secretan IgA (e
IgG en algunas especies) al calostro y a la leche, que
el neonato es capaz captar mediante receptores
especficos IgG de la luz intestinal y pasarla a la
sangre
Supresin por la IgG de las respuestas
de anticuerpos de clulas B novatas
3. Anticuerpos de membrana como
receptores de las clulas B
Ontogenia de las clulas B: Expresin de
distintos isotipos en funcin del grado de
diferenciacin celular.
Pre
BCR
IgM IgM IgD
IgE
IgA
IgM
IgG4
IgG3
IgG2
IgG1
Complejo receptor para antgeno, y sus
co-receptores, en linfocitos B maduros
(Fearon 2000)
Complejo receptor
BCR IgM (u otro isotipo en B memoria)
Iga e Igb ITAM
Co-receptores (co-ligan)
ComplejoCD19/CD21/CD81(TAPA-1)
CD21 une C3d
CD19 Lyn amplificacin Tk de familia Src
Receptores coestimuladores
CD22, FcIg antagonizan CD19
reclutando PTP (Poe 2001)
CD72 antagoniza ITIM
CD40 activa NFkB
CD19/CD21
Ag-C3d
ITAM
CD40
Transduccin de seal de
reconocimiento antignico en clulas B
Ag-Costimuli (C3d)
SHP-1
SHIP
(PTP)
Costimuly-dependent
inhibition of PTP
CD22
FcIgG
Stimuly dependent
Tirosine kinase
activation
Activation of PTP by
negative costimulators
CD21/CD19
Lyn

CD72


ITIM
CD40
NFB
ITAM
SyK
proliferacin
IgM
IgaIgb
Slp65
ITAM-dependent
signal amplification
Diferenciacin
Costimuly-dependent
activation of NFB
4. Usos diagnsticos y teraputicos
Tcnicas analticas/diagnsticas: miden generalmente
fuera del organismo por tcnicas "in vitro" algn
parmetro, ej. nivel srico de Ig A
ELISA enzima inmunoensayo mediadores, seropositividad
WESTERN inmunoelectroforesis de protenas,
IMMUNOHISTOQUIMICA, biopsias,
NEFELOMETRIA turbidometra, Ig sricas
CITOMETRIA DE FLUJO Diagnostico leucemias

Tcnicas teraputicas: diseadas para curar.
Tratamiento antineoplsico destruccin clulas tumorales
Tratamientos antiinflamatorios. Neutralizacin de mediadores
proinflamatorios
4. Uso de anticuerpos en el laboratorio
Fundamento: Pueden ser utilizados como herramientas
capaces de reconocer especficamente y a las que nosotros
podemos sujetar, localizar o medir.
Especificidad en el reconocimiento aportada por la regin
Fab del anticuerpo.


Posibilidad de marcaje: radioactivo, enzimatico,
fluorescente, con puente biotina-avidina. Deteccin y
medida.
Unin a soportes (magnticos o de plstico) por regin Fc.
Se paracin y purificacin molecular y celular.
1. Ag.
2.
*
3.
Cuantificacin de antgeno
Miden molculas mediante anticuerpos indicadores
unidos a otras radioactivas (RIA) o a enzimas
(ELISA), comparan con una curva estndar con
concentraciones conocidas de la sustancia problema.
ELISA o RIA competitivo. Antgeno pegado. El
antigeno de la muestra inhibe la unin de un anticuerpo
indicador al antgeno pegado al pocillo.
ELISA o RIA sandwich. 1
er
anticuerpo pegado captura
antgeno segundo anticuerpo indicador unido a enzima o
radiomarcado reconoce otro determinante del antgeno.
Identificacin, purificacin y
caracterizacin de antgenos proteicos
Inmunoprecipitacin Para separar una protena de
otras sustancias se usa un anticuerpo especifico para
precipitarla. Se lava y se libera el antgeno por cambio
de pH que reduce la afinidad de la unin Ab-Ag.
Western e inmunoblot separacin analtica por
electroforesis en gel de (SDS)-poliacrilamida separa
protenas por a su peso molecular que son transferidas a
un filtro poroso por capilaridad. Las protenas son
reconocidas por anticuerpos radiomarcados o unidos a
enzimas.
Identificacin, purificacin y
caracterizacin de clulas
Marcaje de superficie celular

Citometria de flujo La expresin de antgenos es
medida en cada clula hacindolas pasar de una
en una por delante de un haz de luz, anticuerpos
marcados fluorescentes son utilizados como
molculas indicadoras.
Localizacin del antgeno en tejidos o clulas
Inmunofluorescencia Anticuerpos fluoromarcados en
microscopia ptica. estructuras no marcadas no se ven,
dificultando la localizacin precisa del marcaje fluorescente.
Inmunofluoescencia de barrido ilumina con lser lee a
varios colores
Inmunohistoqumica: Utilizacin en microscopia ptica de
anticuerpos unidos a enzimas que a partir de sustratos
incoloros producen compuestos coloreados e insolubles que
precipitan en la posicin del ag .
Microscopia inmunoelectrnica: Utilizacin en
microscopia electrnica de anticuerpos unidos a compuestos
electrodensos, como el oro coloidal.
Uso de anticuerpos para separacin
celular.
Mtodos de fase slida
Panning fijacin de anticuerpos por su regin Fc a una
fase slida. Clulas portadoras del antgeno se unen al
soporte. lavado y separacin mecnica o qumica.
MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) anticuerpos
unidos a micropartculas magneticas por su regin Fc
son retenidos en una matriz ferromagntica (fase slida)
cuando se aplica un campo magntico. Clulas
portadoras del antgeno se unen al soporte. lavado y
elucin por eliminacin del campo magntico.

Mtodos fluorescentes inteligentes
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)
anticuerpos unidos a compuestos fluorescentes son
reconocidos en la superficie de cada clula.
Clulas portadoras de las combinaciones de
antgenos seleccionadas son reconocidas una a una y
en funcin de las combinaciones de parmetros
seleccionados el aparato toma decisiones
Aplica un campo elctrico que desva trayectoria de
cada de la clula hacia el contenedor de fraccin
deseado.

5. Terapia con anticuerpos monoclonales
from magical bullets to smart bombs
Tecnologa anticuerpos monoclonales 1975.
Limitaciones de anticuerpos murinos
Vida media corta en humanos
No interaccionan ptimamente con sistemas efectores humanos
Estimulan formacin de antianticuerpos (reacciones anafilcticas)
Anticuerpos humanizados
200 anticuerpos distintos en pruebas clnicas y a diferencia
de antiangiognicos estn funcionando en terapia
antitumoral.
Estimulan activacin complemento, ADCC, fagocitosis.
5. Uso teraputico de los anticuerpos
Radioconjugados
Fsforo, Estroncio Yodo Ytrio I-antiCD45 leucemias mieloides
agudas
Zevalin antiCD20 de ratn vida corta Itrio 90 emisinb
Bexxar antiCD20 de ratn Iodo131
Quimioconjugados
AntiCD33 Mylotarg conjugado con chaleomicinna (CMA-676)
produce especies altamente reactivas que daan el DNA e inducen
apoptosis.
Se emplea en leucemias mieloides agudas. El antgeno CD33 se
endocita al ser reconocido por el anticuerpo anti CD33.
AntiCD22 Conjugados con RNAsas se experimentan en linfomas.
Anticuerpos puros
AntiCD40 induce AICD en linfomas.
AntiCD20 mata clulas de linfomas y leucemias (depende de
polimorfimo Receptores Fc).
Anticuerpos sin conjugar
Terapia selectiva
Anti CD52 Campath 1H 2001tumores de clulas B,
enfermedad mnima residual, rechazo de rganos e
injerto contra husped, enfermedades autoinmunes
AntiCD20 Rituximab 1999 para linfomas y Leucemias
de clulas B
Eliminacin de clulas indeseables de inculos
para trasplante de mdula sea.
AntiCD3 OKT-3 Purgado de linfocitos T de inculos
alognicos anti-CD3
Purgado de clulas tumorales de inculos autlogos.
Conjugados con partculas magnticas
AntiCD34 para purificacin de clulas madre
hematopoiticas (CD34+) por seleccin
inmunomagntica.
Permite purificar clulas madre a partir de sangre
perifrica.
Antagonistas de citocinas
Anticuerpos anticitocina Anti-TNFa
Neutralizan mediadores proinflamatorios
Tienen un efecto drstico efecto antiinflamatorio

Enfermedad de Chron, Artritis reumatoide.

Receptores solubles de TNF
Tambin neutralizan TNF pero tienen vida ms corta.
Quimeras con regin Fc. IgG. alargan vida media del
receptor soluble


6. Produccin de anticuerpos
1. Obtencin de antisueros (anticuerpos policlonales)
2. Sntesis de anticuerpos monoclonales
3. Reduccin de su inmunogenicidad. Sntesis de
anticuerpos quimricos


Obtencin de antisueros
(anticuerpos policlonales)
Uso diagnstico

VENTAJAS: rpido y
de bajo coste
INCONVENIENTES:
Reproducibilidad limitada,
cantidad limitada de Ab.
Sntesis de anticuerpos monoclonales
Kohler G. Y Milstein C. (Nature, 1975).

- PROTENA
- PLSMIDO
- CLULAS

-VA: parenteral,
intramuscular...
-DOSIS: 3/4 inoculos
-ADYUVANTES Y
CARRIERS.
CEPA: BALB/c, Y3
PROTENAS VIRALES
MTODOS ELECTRQUICOS
CEPAS: P3/x63.Ag8.653,
NSI/0, NSI/1
ELISA, IFI, RIA, WESTERN,
INMUNOCITOQUMICAS,
FACS.......
- DILUCIN
- AGAR
Problemas para el uso teraputico
inmunogenicidad de los anticuerpos
xenognicos
Disminucin de la Inmunogenicidad
de los anticuerpos
Anticuerpos xenognicos
estimulan la formacin de antianticuerpos
Anticuerpos quimricos
regiones constantes humanas funciones efectoras
Anticuerpos humanizados
reemplazo de regiones marco originales por otras
humanas para disminuir la inmunogenicidad.

Sntesis de anticuerpos quimricos
Morrison et al.(PNAS, 1986 ) y Boulianne
(Nature, 1984).
Variantes biotecnolgicas
Quimeras con regin Fc. alargan vida media de la molcula
asociada

Anticuerpos biespecficos.

Inmunoliposomas liposomas recubiertos de anticuerpos
monoclonales
letales como transportadores de sustancias toxicas
intracelulares ej. RNAasas
El toque humano ha permitido el uso
clnico
Anticuerpos quimricos (1995-)
Simulect rechazo
Remicade Crhon
Humanizados
Herceptin (1998) cncer de mama metasttico que expresa EGF receptor
Zenapax (1997) (CD25)
Campath antiCD52
Xolair anti IgE asma alrgica
Efalizumab psoriasis
200 tipos ms estn actualmente utilizndose en ensayos clnicos en humanos.