Zaključni procesi pri

proizvodnji bioloških
učinkovin

izolacija in čiščenje
 Proces proizvodnje biotehnološkega zdravila

1. Ekspresijski sistem: vektor in gostitelj

2. Sistem proizvodnje kompatibilen z ekspresijskim
sistemom
3. Sistem izolacije in čiščenja
4. Farmacevtska oblika - formulacija
5. Identifikacija in karakterizacija aktivnega
produkta-proteina
Proces proizvodnje biotehnološkega zdravila

1. Ekspresijski sistem: vektor in gostitelj

– Izolacija, identifikacija, kloniranje gena, ki kodira

iskani protein.
• Konstrukcija vektorja ki vsebuje gen in dejavnike za
kontrolo ekspresije (promotor, signalna zaporedja za
izločanje iz celice)
• Vnos vektorja v izbran ekspresijski sistem (Escherichia
coli, Saccharomyces cerevisiae, sesalske celice, gensko
spremenjene rastline)
Proces proizvodnje biotehnološkega zdravila

2. Sistem proizvodnje kompatibilen z

ekspresijskim sistemom

• Optimizacija pogojev za gojenje gensko spremenjenega

ekspresijskega sistema da dosežemo izražanje proteina
v zadostni količini.

• Izbor ustreznega medija, pogojev

rasti in opreme (bioreaktor…)
Proces proizvodnje biotehnološkega zdravila

3. Sistem izolacije in čiščenja

• Cilj: iskani produkt (protein) iz naravnega okolja

(tkiva, celice, fermentacijske brozge) izolirati do
ustrezne čistote in koncentracije.

• Izbira ustreznih metod/zaporedja metod in

povečevanje obsega “scale up”
Proces proizvodnje biotehnološkega zdravila

4. Farmacevtska oblika – formulacija

• Liofilizacija, sterilizacija
• Ohranitev biološke aktivnosti (ustrezna
konformacija produkta v raztopini)
• Stabilizacija (glicerol, albumin), shranjevanje
(nizka T)
Proces proizvodnje biotehnološkega zdravila

5. Identifikacija in karakterizacija aktivnega

produkta-proteina

• Aminokislinsko zaporedje
• Tridimenzionalna struktura
• Biološka aktivnost
• Postranslacijske modifikacije (glikozilacije…)
 Sistem izolacije in čiščenja

1. Ločevanje netopnih komponent

2. Izolacija/koncentriranje produkta – grobo čiščenje
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske
metode)
4. Procesi povezani z pripravo farmacevtske oblike
(fino čiščenje)
 1. Ločevanje netopnih komponent

• Separacija celic (ločevanje celic od tekočega medija)

• Razbitje celic
• Odstranjevanje celičnih fragmentov

izločanje v medij
• Metode
– Filtracija
– Centrifugiranje
– Mehanske in kemijske
metode razbitja celic citoplazma

periplazma

proteini
inkuzijska telesca
1. Ločevanje netopnih komponent

Filtracija

• Ločevanje bioprocesne brozge v koncentrirano (filtracijsko pogačo) in razredčeno

komponento (filtrat) s potiskanjem skozi filtrirni medij, ki prepušča tekočino in
zadržuje trdne delce.

• Sila: razlika tlakov (vakuum), centrifugalno polje

• Načini filtracije: globinska, skozi filtrno pogačo, tangencialna

 1. Ločevanje netopnih komponent

Filtracija
Separacijske lastnosti filtrnega medija (membrane):
Na+
(0,4 nm) Staphylococcus
glukoza hemoglobin virus gripe (1000 nm)
(7 nm) Pseudomonas
H2O (1 nm) (100 nm) diminuta
(0,2 nm) (280 nm)

MIKROFILTRACIJA

soli,nizko
molekularne spojine
ULTRAFILTRACIJA

celice,
emulzije, bakterije,
NANOFILTRACIJA virusi, koloidi polimeri
makromolekule,
proteini
REVERZNA OSMOZA vitamini, sladkorji

1 10 100 1000 10000

0,1
velikost por (nm)
1. Ločevanje netopnih komponent

Filtracija

Mikrofiltracija
velikost por 0,1-10 μm

• Za ločevanje celične mase od procesne tekočine

• Za odstranjevanje celičnih fragmentov po razbitju celic
• Rotacijski vakumski filtri
• Tangencialna mikrofiltracija

http://www.komline.com/docs/rotary_drum_vacuum_filter.html
1. Ločevanje netopnih komponent

Filtracija

Ultrafiltracija
velikost por 1-100 nm

• Za koncentriranje produkta (proteina)

• Odstranjevanje soli, menjava pufra
(diafiltracija)
• Ločevanje proteinov z različno MW
(vsaj 10x razlika)
• Odstranjevanje virusov in virusnih antigenov

obrat za ultrafiltracijo vode v mestu Jachenhausen

1. Ločevanje netopnih komponent

Filtracija

Nanofiltracija
velikost por 0,1-1 nm

• Za koncentriranje antibiotikov, peptidov,

molekul z MW med 100 in 3000 Da

Nanofiltracija vode v Mery-sur-Oise, predmestje Pariza

1. Ločevanje netopnih komponent

Filtracija

Reverzna osmoza
velikost por <0,1 nm

• Za koncentriranje spojin z majhnimi molekulskimi masami

• Čiščenje vode
1. Ločevanje netopnih komponent

Centrifugiranje

• Ločevanje ali koncentriranje suspendiranih delcev iz

tekočega medija s pomočjo centrifugalne sile
• Uporaba
– ločevanje celic od procesne tekočine
– odstranjevanje celičnih ostankov po razbitju celic
– separiranje subceličnih organelov (diferencialno
centrifugiranje)
– ločevanje oborjenih proteinov
• Delovanje:
– kontinuirno
– šaržno (“batch”)
1. Ločevanje netopnih komponent

Centrifugiranje
Centrifuga z diski
Cevna centrifuga

Centrifugalni dekanter
1. Ločevanje netopnih komponent

Razbitje celic

Fizikalni princip Kemijski princip

Mehanske metode Ne-mehanske metode

Encimi

Organska topila
Kroglični mlini Osmozni šok Površinsko aktivne snovi
Homogenizatorji Zamrzovanje/odtajanje Kelirajoča sredstva
Francoska stiskalnica Toplotni šok Kaotropne spojine
Koloidni mlini Sušenje
Sonikacija
1. Ločevanje netopnih komponent

Razbitje celic

Mehanske metode

Kroglični mlini

Homogenizatorji

Francoska stiskalnica

Koloidni mlini

Sonikacija
1. Ločevanje netopnih komponent

Razbitje celic
Kroglični mlini

• Celice se stresajo z majhnimi abrazivnimi delci

• Strižne sile, mletje in udarci delcev
• Za celice s trdno celično steno (kvasovke, spore, enocelične alge, glive)
 2. Izolacija/koncentriranje produkta – grobo
čiščenje

• Ekstrakcija –pridobivanje učinkovine ali skupine učinkovin iz zmesi

ali celic v topilo – lipofilne snovi, antibiotiki
• Obarjanje
• Centrifugiranje
• Membranska filtracija (tangencialna ultrafiltracija) – koncentriranje
in razsoljevanje
• Ionsko-izmenjevalne ali adsorpcijske smole
2. Izolacija/koncentriranje produkta – grobo čiščenje

Obarjanje

• Uporabna metoda v začetnih korakih čiščenja in izolacije

• Za ločevanje proteinov od drugih komponent v procesni tekočini

• S spreminjanjem fizikalno-kemijskega okolja (pH, vrsta topila, ionska

moč, vrsta ionov) vplivamo na topnost proteinov → obarjanje
• Amonijev sulfat, organska topila (metanol, etanol, aceton, propanol),
polietilenglikol, triklorocetna kislina, neionski polioksietilenski detergenti.
• S postopnim povečevanjem ionske jakosti dosežemo frakcionirno
obarjanje
 3. Čiščenje / koncentriranje produkta
(kromatografske metode)

• Kromatografske metode zagotavljajo visoko stopnjo čistote produkta (98-99%)

• Glede na mehanizem ločevanja komponent v vzorcu

– Porazdelitvena (reverzno fazna, normalna)
– Adsorpcijska -hidrofobna
– Ionsko izmenjevalna
– Gelska izključitvena
– Afinitetna
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Ionsko-izmenjevalna
kromatografija

• Ločevanje na osnovi različnih elektrostatskih interakcij

med molekulami v mobilni fazi in nabitimi skupinami
stacionarne faze
• Pogosto uvrstimo v začetne stopnje čiščenja
• Elucija: sprememba pH, ionske jakosti
• Odstranjevanje nečistoč
• Dodajanje argininskega repka – vezava na kationske
izmenjevalce
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Adsorpcijska-hidrofobna
kromatografija
• Ločevanje glede na moč adsorpcije (hidrofobne interakcije) na stacionarno fazo
• Sledi ionsko izmenjevalni kromatografiji (višje koncentracije soli – izpostavijo
hidrofobne ak na površini)
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Afinitetna kromatografija
• Ločevanje na osnovi razlik v biološki afiniteti do liganda, imobiliziranega na nosilcu.
• Zelo učinkovita kromatografska metoda, zagotavlja visoko stopnjo čistote
• Lahko zmanjšajo število korakov v procesu izolacije in čiščenja
• Omejitev: velika količina liganda
• Prekinitev interakcij:
– prost ligand, sprememba dielektrične konstante, ionske moči, pH mobilne faze, sprememba
temperature, ultrazvok, denaturanti
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Afinitetna kromatografija
• Ligandi:
– Protitelesa – antigeni
– Protitelesa – protein A, G (Fc regija)
– Encimi - substrati, inhibitorji encimov
– Glikoproteini – lektin
– Afinitetni označevalci:
• Histidinski označevalec (His-tag) –Nikelj ali kobalt kolone

• Glutation S transferaza (GST) – glutation

3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Gelska izključitvena
kromatografija

• Ločevanje na osnovi velikosti in oblike

• Stacionarna faza: inertni geli s porami
• Uporabna šele v zadnjih stopnjah čiščenja
(razsoljevanje, zamenjava pufra,
odstranjevanje dimerov in agregatov)
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Tekočinska kromatografija visoke

ločljivosti (HPLC)
3. Čiščenje / koncentriranje produkta (kromatografske metode)

Kromatografija z razširjeno (zvrtinčeno) plastjo

(expanded / fluidized bed chromatography)

doseganje nanašanje elucija v

pufer ustreznega bioprocesne manjši
pretoka brozge volumen

• Uporabna brez predhodnega filtriranja ali centrifugiranja (manjše število posameznih

stopenj
• Delci stacionarne faze niso stisnjeni na koloni
• Uporabna na industrijskem nivoju
 4. Procesi povezani z pripravo farmacevtske oblike
(fino čiščenje)
• sterilna filtracija (0,22 μm)
• liofilizacija (krioprotektivi – glukoza, sukroza, albumin,
aminokilsline) dodajanje pomožnih snovi, ki stabilizirajo končni
produkt (serumski albumin, aminokisline, polioli, površinsko
aktivne snovi)
• aseptično polnjenje
 NEČISTOTE

POVEZANE S PROIZVODNJO

IZHAJAJO IZ IZHAJAJO IZ
EKSPRESIJSKEGA TEHNOLOGIJE
SISTEMA PROIZVODNJE IN ČIŠČENJA POVEZANE S PROIZVODOM

• virusi • komponente gojišča • denaturirani proteini

• proteini in DNA eksp.sistema
• endotoksini
• N- in C- terminalna
heterogenost
• glikozilacijski vzorci
• substitucija in delecija
aminokislin
• reagenti pri čiščenju • konformacijski izomeri
• kovinski ioni • dimeri in agregati
• materiali iz kolon • deamidirani proteini
• inhibitorji proteaz • nepravilne disulfidne vezi
• razpadni fragmenti proteinov
 Splošna shema proizvodnje biotehnološkega zdravila

Pridobivanje rekombinantnega humanega eritropoetina

bioreakcija v sesalskih CHO celicah volumen izkoristek

odstranjevanje celic
1. centrifugiranje
100 l 100 %

koncentriranje in razsoljevanje supernatanta

ultrafiltracija (10 kDa cut-off)
2.
odstranjevanje oborjenih nečistot 5l 88,75 %
centrifugiranje

Ionsko-izmenjevalna kromatografija 0,49 l 51,0 %

3. adsorpcijska hidrofobna kromatografija 0,14 l 90,0 %

gelska izključitvena kromatografija 0,46 l 93, 5 %

sterilna filtracija
4.
rHuEPO >99 % 0,5 g 38 %
 Splošna shema proizvodnje biotehnološkega zdravila

Pridobivanje rekombinantnega MAb proti hepatitisu B

ekspresija v transgenih rastlinah

količina izkoristek
Nicotiana tabacum

mehansko mletje listov v

1. ekstrakcijskem pufru
60 kg

centrifugiranje
odstranjevanje rastlinskih delcev

2.

afinitetna kromatografija z razširjeno plastjo

(protein A)

3.

4.
1,6 g 60 %
Mab anti hepatitis B >96 %