OSNOVE FARMACEVTSKE

BIOTEHNOLOGIJE

prof.dr. Borut Štrukelj

 Kratek CV
Redni profesor na UL za področja:
- farmacevtska biotehnologija (MF-UL, FFA-UL, MF-UM)
-rastlinska biokemija (FKKT-UL)
-rekombinantna tehnologija DNA (BF-UL)
- farmakologija (VŠZI-UP)

Izvedenec na EMEA v Londonu

Izvedenec na Ph. Eur. V Strassbourgu
Agencija za zdravila RS

Podoktorsko izpopolnjevanje: WSU ZDA, Wageningen

University Netherlands
Sistem predavanj, vaj in izpitov
Uvod, regulativa in etika
Genska informacija in kako do nje
Ekspresijski sistemi
Izolacija, identifikacija bioloških zdravil
Formulacija, nosilni sistemi
Peptidi
Monoklonska in poliklonska protitelesa
Citokini in rastni dejavniki
Insulin in ostale rekombinantne učinkovine
Osnove genskega zdravljenja
Biotransformacije, vitamini in antioksidanti
Rastlinsko in živalsko celično in tkivno inženirstvo
 Izpitni roki
-20.februarja ob 18h, Predavalnica na dvorišču
-23. aprila ob 18h, Predavalnica na dvorišču
-28. maja ob 18h, P1
-17. september ob 8h, P1

Vaje
vključene v vaje iz Farmakognozije
Literatura: Biološka zdravila: od gena do učinkovine
Govorilne ure petek, 12h-13h
 UVOD

1. Od začetkov do dobe moderne biotehnologije

Definicija biotehnologije :
Biotehnologhija se najlažje izrazi kot uporaba katerekoli tehnologije, ki temelji na živih
organizmih ali bioloških sistemih, z namenom koristiti človeku in okolju.

Razlikujemo več zvrsti biotehnologij, ki se med seboj zelo prepletajo:

1. Farmacevtska biotehnologija 5. Mikrobna biotehnologija

2. Živilska biotehnologija 6. Medicinska biotehnologija

3. Rastlinska biotehnologija 7. Okoljevarstvena biotehnologija

4. Živalska biotehnologija
Časovna shema razvoja biotehnologije od začetkov do danes:

2000 p.n.š. Kitajci fermentirajo riževo vino.

1750 p.n.š. Sumerci varijo pivo.
Kitajci uporabljajo plesniva sojina semen kot antibiotik za zdravljenje turov
500 p.n.š.
in razjed na koži.
100 Uporaba uprašenega bolhača (Chrisantemium) kot insekticid, na Kitajskem.
1590 Janssen odkrije prvi mikroskop.
1663 Hook prvič opiše celice.
1675 Leeuwenhoek okrije bakterije.
1797 Jenner prvič uporabi virusno cepivo proti vodenim kozam.
1830 Odkrijtje proteinov.
1833 Izolacija prvih encimov.
Odkritje Escherichia coli, ki pozneje postane eden glavnih biotehnoloških
1855
orodji pri raziskovanju, razvoju in proizvodnji.
Mendel pri študijah križanja graha odkrije, da se lastnosti prenašajo iz
staršev na potomce s pomočjo ločenih, samostojnih enot, ki so pozneje
1863
imenovane GENI. Njegova opažanja zaznamujejo začetek novega področja
imenovanega GENETIKA.
1869 Miescher odkrije DNA v spermi postrvi.
 1954 Razvoj tehnik priprave celičnih kultur.
1955 Izolacija prvega encima vpletenega v sintezo nukleinskih kislin.
Fermentacijski postopki so dodelani na Japonskem.
1956
Kornberg odkrije DNA-polimerazo I, kar vodi v razumevane replikacije DNA.
Pokazano je, da je anemija srpastih celic posledica mutacije ene amino
1958
kisline.
Tudi v Odkritje inerferona.
pedesetih Prvi sintezni antibiotik.
letih
1960 Odkritje informacijske RNA.
1965 Harris in Watkins naredita uspešno fuzijo mišjih in človeških celic.
Razvozlan je genetski kod, pokazano je bilo, da tripleti nukleinskih baz
1966
(KODON) določajo vseh 20 amino kislin.
1967 Prvi avtomatiziran sekvenator je dovršen.
1969 Prva sinteza encima v in vitro pogojih.
1970 Prva celotna sinteza gena.
Odkritje prvega restrikcijskega encima, s pomočjo katerega je možno rezati
1971
genetski material.
Odkritje, da je 99% genoma človeka, šimpanza in gorile podobnega.
1972
Začetna dela s prnosi zarodkov.
Cohen in Boyer dovršita tehnike rezanja in ponovnega združevanja DNA
 NIH ustanovi Recombinant DNA Advisory Committee za nadzor nad
1974
raziskavami v rekombinantni genetiki.
Asilomarska konferenca (moratorij na raziskave s pomočjo genskega
1975 inženiringa).
Proizvodnja prvih MONOKLONSKIH PROTITELES.
Orodja rekombinantne tehnologije so prvič uporabljena pri človeški genetski
bolezni.
1976 Molekularna hibridizacija je uporabljena za diagnozo prenatalne -talasemije.
Ekspresija genov kvasovk v E. coli.
Odkritje določevanja nukleotidnega zaporedja DNA; prvi delovni sintezni gen.
Prva ekspresija človeškega gena v bakterijah.
1977 Odkritje metod določevanja nukleotidnega zaporedja DNA s pomočjo
elektroforeze.
Prva proizvodnja humanega insulina.
1978 Znanstveniki iz Severne Karoline pokažejo, da je možno vpeljati specifične
mutacije na specifična mesta v DNA.
1979 Prvič je sintetiziran človeški rastni faktor.
Ustanovljeno je prvo podjetje za razvoj izdelkov narejenih s pomočjo
genskega inženirstva.
Tudi v Odkritje polimeraz.
sedemdesetih
Dodelane so tehnike za hitro določevanje nukleotidnega zaporedja DNA.
RNA splicing.
 Vrhovno sodičše v ZDA odobri patentiranje genetsko spremenjenih
življenskih oblik, ki EXXON-naftni družbi omogoči patentiranje
1980 mikroorganizmov, ki jedo nafto.
Znanstveniki uspešno vstavijo gen za človeški interferov v genom bakterij.
Znanstveniki na univerzi v Ohio-ju naredijo prvo transgeno miš.
1981
Kitajski znanstveniki prvi uspešno klonirajo ribo-zlatega krapa.
Odkritje PCR (polymerase chain reaction)- reakcije .
Prva transformacija rastlinskih celis s pomočjo TI-plazmida.
1983
Sintetiziran je prvi sintezni kromosom.
Najdeni so prvi specifični markerji genetsko pogojenih bolezni.
Razvita je DNA-fingerprint tehnologija.
1984 Razvito je prvo cepivo pridobljeno s pomočjo genskega inženirstva.
Klonirano in določeno je celotno nukleotidno zaporedje HIV.
Najdeni so genetski markerji za bolezni ledvic in cistične fibroze.
Testirane so prve transgene rastline odporne na insekte, viruse in bakterije.
1985
NIH potrdi smernice za izvajanje poskusov GENSKEGA ZDRAVLJENJA na
človeku.
Prvič je opisano kako združiti protitelesa in encime za proizvodnjo zdravil.
1986
Prva testiranja transgenega tobaka
 Frostban, genetsko spremenjena bakterija, ki inhibira nastanek ledu na
1987
gojenih rastlinah, je sproščena na krompirjeva polja in polja jagod v Kaliforiji.
Hardvardski molekularni biologi dobijo nagrado za patentiranje prve
transgene miši.
1988
Podeljen je patent proteaze, ki so rezistentne na agresivna belila v pralnih
sredstvih.
1989 Prvi poljski poskus transgene ratline tobaka odporne na viruse.
Študije DNA za določevanja in napredovanja evolucije.
Tudi v Odobrena je uporaba rekombinantnega cepiva v Evropi.
osemdesetih Uporaba mikroteles pri odpravljanju posledic rzlitja nafte- bioremediativna
tehnologija.
Chy-MaxTM naredi rekombinantni kimozin, encim, ki je udeležen pri pripravi
sirov. Prvi produkt pridobljen s pomočjo genskega inženirstva, ki je bil vpeljan
v hrano.
1990 Začne se HUMAN GENOME PROJECT.
Prvo dovoljenje za gensko zdravljenje deklice z imunsko boleznijo.
Prva transgena krava, ki izloča humano mleko, uporabno v dietetiki.
FDA naznani, da genetsko spremenjena hrana ni dedovano nevarna in zato
1993
ni potrebna dodatna regulacija.
FLAVRSAVRTM je prvi transgeni paradižnik, za katerega FDA odobri trženje
Odkrit je prvi gen raka dojke.
1994
Odobrena je rekombinantna humana DNaza, ki razgrajuje ekscesno DNA v
 Prva transplantacija kostnega mozga iz pavijana v človeka.
Znano je prvo celotno nukleotidno zaporedje živečega organizma, ki ni virus-
bakterija Hemophilus influenzae.
1995
Klinična uporaba genskega zdravljenja, modulacije imunskega sistema in
protiteles pridobljenih s pomočjo genskega inženirstva za zdravljenje rakavih
obolenj.
Škotski znanstveniki uspešno klonirajo ovco Dolly.
1997
Znanstveniki iz Oregona trdijo, da so klonirali dve opici.
Znanstveniki iz univerze Hawajev klonirajo tri generacije miši iz jeder odraslih
jajčnih celic.
Uporaba embrionalnih zarodnih celic za regeneracijo tkiv.
Japonski znanstveniki iz Kinki univerze uspešno klonirajo osem identičnih
teličkov iz genetskega materiala odraslih krav.
1998 Določeno je prvo celotno nukleotidno zaporedje DNA živali-črva
Chenorabditis elegans.
Dobljena je tudi groba knižnica človeškega genoma, ki prikazuje lokacijo več
2004 kot
30 000 genov.
Odkrita RNA interferenca
 Sodobna farmacevtska
biotehnologija
Priprava bioloških učinkovin in zdravil
Fermentacija in polsinteza antibiotikov,
kemoterapevtikov
Gensko zdravljenje
Celično in tkivno iženirstvo
 KAJ SO BIOLOŠKA ZDRAVILA?

Izraz “Biološka zdravila” je preširok, saj

lahko zajema tako sodobna biološka
zdravila, pridobljena s tehnologijo
rekombinantne DNA, kot tudi zdravila,
pridobljena z izolacijo iz rastlin ali živali
(alkaloidi, flavonoidi, kri in krvni proizvodi)
ali fermentorsko biotehnologijo (antibiotiki,
steroidi, vitamini)
 RAZELITEV BIOLOŠKIH ZDRAVIL

BIOLOŠKA
ZDRAVILA
MONOKLONSKA
PROTITELESA

BIOLOŠKA ZDRAVILA
PRIDOBLJENA S
SINTEZO

REKOMBINANTNA
BIOLOŠKA
GENSKE (BIOTEHNOLOŠKA)
BIOLOŠKA ZDRAVILA UČINKOVINE ZDRAVILA
PRIDOBLJENA
Z IZOLACIJO

Večino sodobnih bioloških zdravil uvrščamo med

rekombinantna biološka zdravila, ki jim pravimo tudi
biotehnološka zdravila. To so rekombinantne
učinkovine, rekombinantna monklonska protitelesa in
rekombinantna cepiva
 Podrobnejša delitev po skupinah:
1) Biološka zdravila, pridoblejna z izolacijo:
rastlinski sekundarni metaboliti (alkaloidi,
flavonoidi, antioksidanti), živalski in človeški
hormoni (insulin, rastni hormon), kri in krvni
izdelki, antibiotiki, steroidi, celično in tkivno
inženirstvo, klasična cepiva

2) Biološka zdravila, pridobljena s sintezo:

sintezni peptidi (kalcitonin, oksitocin,
vazopresin, itd)
3. Genske učinkovine: terapevtski geni,
vstavljeni v vektor za vnos v organizem s
pomočjo virusnega ali nevirusnega vnosa

4. Monoklonska protitelesa, pridobljena s

klasično hibridomsko tehnologijo

5. Rekombinantna biološka zdravila

(biotehnološka zdravila): rekombinantni
proteini, rekombinantna monoklonska
protitelesa (končnica mab) in
rekombinantna cepiva
GLOBALNO TRŽIŠČE BIOLOŠKIH ZDRAVIL

Tržni delež bioloških zdravil narašča iz leta

v leto:

650

550 14
18%
10

401
Tržni delež 8
Biofarmacevtikov 296
v%
6

Prodaja v
mjd US$
90
55
17 32

1999 2002 2005 2009 E

Celokupna prodaja Prodaja Biofarmacevtikov

 ZAKAJ NA PODROČJU BIOLOŠKIH ZDRAVIL
NI GENERIKOV?
Za razliko od majhnih, sinteznih zdravil, velja za biološka zdravila
rek: od produkcijskega procesa je odvisna strutura nastalega
proteina!

Značilnosti bioloških zdravil:

imajo visoko molekulsko maso
imajo kompleksno trodimenzionalno strukturo
proizvedeni so s pomočjo živih organizmov
so pogosto heterogene molekule
zelo težko se jih ovrednoti v celoti s fizikalno-kemičnimi analitičnimi
metodami in določi njihovo biološko delovanje (še posebej večje in
pa glikozilirane molekule )
ponovljivost njihovega proizvodnega procesa je odvisna od biološke
aktivnosti, inhišnih standardov
so lahko imunogeni
kot posledica tega, je njihova proizvodnja veliko bolj zapletena.
 a) Kompleksnost bioloških zdravil
Razlika v velikosti med nekaterimi
učinkovinami:
Zdravilo Molekulska masa (kDa) Število aminokislin

Propranolol 0.259 Jih ni

Fluoksetin 0.346 Jih ni

Kalcitonin 4.5 32

Humani rastni hormon 22.0 191

Faktor VIII 264 2332

Kompleksnost strukture nekaterih bioloških zdravil
 b) Razlike v potrebnem naboru
identifikacijskih metod
Določitev strukture in čistote majhnih sinteznih
molekul: IR, UV, MS, NMR

Določitev strukture in čistote bioloških molekul:

FTIR, CD, Edmanova degradacija, X-žarkovna
analiza, NMR, SDS-PAGE, CE, IF, peptidno
mapiranje, glikansko mapiranje, Western blot
analiza, ELISA, MALDI-TOF masna
spektrometrija
 c) Potencialna imunogenost
Biološka zdravila so proteini ali glikoproteini in
lahko v organizmu izzovejo imunski odgovor

Ime protein indikacija % bolnikov

produkta s protitelesi
Refacto Faktor VIII hemofilija 24-30%

Intron A, Interferon Hepatitis 7-12%

Roferon A alfa C
Avonex, Rebif,
Betaseron
Interferon Multipla 12-45%
beta skleroza
 d) Proizvodni proces

Sintezne molekule:
relativno enostaven
proces sinteze

Biološka zdravila:
zapleten proces z
uporabo živih celic ali
organizmov
NA OSNOVI PRIKAZANEGA TRDIMO, DA GENERIKOV
PRI BIOLOŠKIH ZDRAVILIH NI!

KLASIČNA
BIOLOŠKA ZDRAVILA ZDRAVILA

Originalna Originalna/
inovativna

Generična

Biološko primerljiva
zdravila
Generična?
 BODOČI TRENDI IN PERSPEKTIVE

- Razvoj bioloških zdravil druge generacije (darbepoetin,

insulini s spremenjeno aminokislinsko sestavo (Lis-pro,
Aspart, glargin), pegilirane rekombinantne učinkovine
(peginterferon, pegfilgastim)

- Razvoj novih transportnih oblik rekombinantnih učinkovin

(intranazalni, pulmonalni, peroralni vnos), razvoj
specifičnih transportnih sistemov (nanodelci, liposomi)

- Genska zdravila (virusni in nevirusni dostavni sistemi,

vnos okvarjenih genov v celico, RNAi tehnologija)
 REGULATIVA
ICH

EMEA

FDA
 ETIKA V BIOTEHNOLOGIJI
Etična vprašanja v kliničnih raziskavah:
Helsinška deklaracija (1964); Evropska
direktiva za klinična preiskušanja (2004)
Primer TGN-1412
Patenti v farmacevtski biotehnologiji