Daniel Raydan 11-10846

Marco Filoseta 11-10330

Motivo prctico:
Los Riones
Tasa de filtracin glomerular (GFR)
Inulina
Problema
Antecedentes
Metodologa
Resultados
Conclusiones

La medicin de la Tasa de
Filtracin Glomerular (GFR), es
una prueba de gran utilidad para
conocer si los riones estn
filtrando el plasma
adecuadamente (depurador), o si
existe indicativo de mal
funcionamiento en el mismo.
Los riones extraen de un volumen
de plasma las sustancias toxicas
excretadas hacia la orina.

Para la determinacin del GFR debe entonces
escogerse una sustancia (X), cuya depuracin sea
equivalente al volumen de plasma filtrado, para ello la
sustancia X debe cumplir:

Debe filtrar libremente
No puede ser reabsorbida, ni secretada,
ni degradada, ni sintetizada a nivel tubular

Cantidad de X filtrada = cantidad de X excretada
La cantidad de X no
filtrada por el rin
pasa nuevamente al,
plasma sanguneo.





La Inulina es un polisacrido
de la fructosa que satisface
las condiciones de
depurador (filtrable, no
secretada, ni absorbida, ni
sintezida anivel glomerular).

Est constituida por
molculas de fructosa
unidas por enlaces B-(1-2)
fructosil-fructosa .

Cmo determinar la concentracin
de inulina?
Esta determinacin puede ser
utilizada como indicador de
GFR en la evaluacin de
funcionamiento renal en
pacientes con enfermedades
de rion.
Estos mtodos comprendan el uso de
(1) Hexoquinasa, (2)
fosfoglucosa isomerasa,
(3) fosfato de 6-glucosa
deshidrogenasa, (4) ATP,
y (5) alcohol
deshidrogenasa
(NADP+)
Mtodo 1 Mtodo 2
(1) Fructosa-
deshidrogenasa, (2)
peroxidasa, (3) 1-metoxy-5-
metilfenazina, (4) N-etil-N-
(2-hidroxy-3-sulfopropil)-
mtoludina,
(5) 4-aminoantipirina
K. Hofer, et al. (1999)
S. Kimata, et al. (2009)
Mucho error asociado
Proceso quimico:
Deteccin de Inulina mediante la
hidrlisis de la Inulina a D-fructosa, para
ello se utiliza una solucin de Inulinasa
(enzima) y el acido 5-quinolineboronico
que selectivamente acordona la D-
fructosa. La adiccin de D-fructosa
aumenta la intensidad fluorescente del
acido 5-QBA.
Reactivos:
Solucin de Inulinasa, Buffer de fosfato,
Acido 5-quinolineborico (5-QBA), buffer
de acetato.


Anlisis Fluorimtrico:
Se mide la intensidad de
fluorescencia del compuesto
fluorescente para diferentes
concentraciones de Inulina
(patrones). De esta forma se
obtiene la curva de calibracin.
Ventajas de la metodologa propuesta:
El mtodo propuesto es sencillo y selectivamente
obtiene la D-fructosa de la Inulina.

El haz dirigido a la muestra
pasa por un filtro, donde se
selecciona la longitud de
onda de incidencia. Se
excita la muestra (radiacin
de excitacin) mediante la
absorcin de un fotn de
luz, produciendo la perdida
de energa vibracional al
colisionar con otras
molculas. La molcula
desciende a otro estado
vibracional emitiendo un
fotn (radiacin emitida).
Este es dirigido a un sistema de tubos y luego a un amplificador ,
conectado a un sistema de lectura que muestra la intensidad de
la fluorescencia, en alguna escala.
Proceso qumico para muestras de Inulina: 2,5 L
de una solucin de inulinasa se agrega a la solucin de
Inulina (50mM buffer de acetato, pH=4,5),
mantenindose a 50C para evitar la reaccin con
inulinasa. Luego de un tiempo 2,5 mL de una solucin
de acido 5-QBA (11g/mL en 200mM buffer de fosfato,
pH=7,4) es agregado a la solucin muestra - La
fluorescencia del acido 5-QBA alcanza su mximo
despus de 20 min.
Proceso qumico para muestras de plasma bovino:
Similar, aunque las protenas del plasma (albumina)
interfieren con el acido 5-QBA. Por lo que la
desproteinacin por calentamiento es usada para
solventar el problema.
Resultados conocidos en el rea:
El acido 5-QBA ha sido usado para diferenciar D-
fructosa de la Inulina (W. Yang et al. 2005).
El acido 5-QBA es una sustancia no fluorescente en
solucin acuosa. Pero su fluorescencia aumenta con la
concentracin de D-fructosa (W. Yang et al. 2005).






Resultados
El pH de la solucin resultante debe ser pH=7,2, que es lo
conveniente para la interaccin D-fructosa con el acido 5-QBA
(W. Yang et al. 2005).








Los azucares ms abundantes en la sangre despus de la D-
glucosa son la D- fructosa y D-galactosa. Sin embargo, los
efectos de la D-galactosa en este mtodo son despreciables
(T. D. James et al. 2007, H. Fang et al. 2004 y Y. Egawa et
al. 2011).

Figura 3: Figurra 22
Se evalu la selectividad del acido 5-QBA en pH=7.2 (ex=315nm,
em=426nm). La Figura 1 muestra que en el rango de 0-90g/mL,
la intensidad de fluorescencia del acido 5-QBA es proporcional a la
concentracin de D-fructosa. Adems, la D-glucosa no afecta la
intensidad de fluorescencia del acido.
D-fructosa
D-glucosa
Figura 3:
D-fructosa
Observaciones:
La respuesta de la Inulina fue similar a la de la misma
concentracin de D-fructosa.
Lo que indica que la concentracin de de D-fructosa puede ser
obtenida de la Inulina.
Figura 3: muestras de Inulina preparadas con un buffer de acetato (ex=315nm y em=426nm)
b C m F
Inulina

8 , 0 m
La siguiente tabla muestra las concentraciones de la Inulina para
soluciones de concentracin conocida entre 27 y 135 g/mL. La
recuperacin est entre 100 y 104%. Resultados similares a los
obtenidos en el trabajo de S. Kimata et al. (2009).
Figura 4 : muestras de Inulina preparadas con plasma bovino (ex=315nm y em=426nm)
Observaciones:
Las concentraciones tpicas en practica son 100-150 g/mL. El
intercepto en esta figura es un poco alto, lo que indica que puede
haber interferencias debido al tratamiento del plasma con
calentamiento.

La concentracin de Inulina es determinada
satisfactoriamente usando inulinasa y acido
5-QBA.
Desproteinacin por calentamiento puede
causar efectos o interferencias sobre el
plasma que deben ser estudiados.
Es el primer rticulo que utiliza el 5-QBA en
la determinacin de Inulina.