PURIFICACIN Y

CONCENTRACIN
CONCENTRACIN
AISLAMIENTO Y PURIFICACIN
CONCENTRACIN
Precipitacin
Sulfato amnico
Solventes orgnicos
Polmeros de alto peso molecular
Adsorcin
Polisacridos aninicos
Polisacridos catinicos
Cromatografa de afinidad
Otros
Ultrafiltracin
Secado
Evaporacin rotatoria
Secado en spray
liofilizacin

CONCENTRACIN POR PRECIPITACIN
Principio general: Precipitacin (insolubilizacin) de un soluto por la accin de un
agente precipitante con el fin de concentrarlo o separarlo de una mezcla.
La solubilidad de una molcula : f (temperatura, fuerza inica, pH,
constante dielctrica).
Tericamente el soluto precipitado debe ser recuperado puro.
El agente precipitante no debe desnaturalizar al soluto y en el mejor de los
casos debe estabilizarlo.
Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente
disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin.
desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa
neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo
ruptura de los puentes de hidrgeno
Esto ocurre porque se facilita la agregacin intermolecular.
AJUSTANDO EL pH
La carga neta de las protena depende del contenido de aa
cidos y de aa bsicos
El valor del pH donde la carga neta de la protena es cero
pI (punto isoelectrico)
Solubilidad es mnina

Ej: contenido de aa cidos pI bajo (4-5)

Ajustando el pH del extracto, de 7,0 hasta 4,0 o 5,0, se
consigue muchas veces eliminar los componentes solubles de
las paredes celulares y numerosas protenas no deseadas.
Este mtodo slo puede usarse cuando la enzima deseado es
estable y soluble a pH bajo.
Ej. Para la purificacin inicial de nuclesido-5'-fosfotransferasa
de la zanahoria.
PRECIPITACIN POR SALES
Disminucin de las interacciones de carga entre el
soluto y el solvente.
FUNDAMENTO: EFECTO DE LA FUERZA INICA
Solubilidad a baja fuerza ionica (0.001 0.02 M)
aumenta con la [ sales] Salting in


La solubilidad a alta fuerza inica (mayor a 0.02 M) disminuye con la
[sales] Salting out





La alta [sal] elimina la esfera de solvatacin de la protena

Las protenas en H
2
O tienden a formar COMPLEJOS
electrostticos precipitan


Al aumentar la [sales] proteina se rodea de contra
iones ms soluble por > interaccin prot-solv
Capturan el H2O > interaccin entre enzimas.
PRECIPITACIN CON SULFATO DE AMONIO
PROCEDIMIENTO
SUFALTO DE AMONIO: Altamente soluble en agua, muy
pura, barata,no tiene efecto sobre la estructura de las
protenas.
Despus de la adicin de sal, protenas precipitadas se
centrifugan y se redisuelven en buffer .
Protenas solubles pueden precipitarse con una
concentracin mayor de la misma sal.
Protena precipitada es salted out.
Sal retira la capa de molculas de agua que rodea a la
superficie de la protena.
Grupos hidrofbicos permiten que la protena se
agregue y precipite.
PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO
Protena
soluble
AGUA
(NH4)2 SO4
Sulfato de amonio
Protena
insoluble
PRECIPITACIN POR SOLVENTES ORGNICOS
Diferente solubilidad de las protenas en solucin acuosa a
solventes orgnicos, disolventes neutros miscibles en agua : etanol,
acetona, butanol.
Bajan el poder de solvatacin de las soluciones acuosas.
Solvente: disminuye constante dielctrica del medio aumenta
atraccin entre molculas cargadas y disminuye su interaccin con
el agua.
Solubilidad de la protena disminuye: grupos hidrofbicos son
protegidos por solvente y grupos inicos son dominantes.
Inverso a fraccionamiento con sales: grupos hidrofbicos son
expuestos.
Puede haber denaturalizacin y se pierde actividad.
Los disolventes orgnicos son agentes de precipitacin
eficaces y adecuados para el trabajo de laboratorio.
Rara vez son empleados a gran escala, a causa de su
inflamabilidad.
La polaridad del disolvente disminuye cuando se le
aaden sustancias menos polares que el agua como el
etanol o la acetona
Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos
inicos superficiales de la molcula proteica, provocando
la agregacin y precipitacin
Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior
hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura
terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin.
La accin de los detergentes es similar a la de los
disolventes orgnicos.

AGENTES PARA LA PRECIPITACIN
Modo Ejemplo Comentario
Adicin de sal neutra
(NH
4
)
2
SO4
Aument las interacciones hidrofbicas entre molculas
de protena neutro;
Sal es retirado antes de la prxima fase de purificacin
(excepto cromatografa de interaccin hidrofbica) por
dilisis, ultra filtracin o filtracin de gel
Adicin de disolvente orgnico. Acetona, etanol Reduce la constante dielctrica de las interacciones
electrostticas entre las molculas de protena; baja
temperatura requerida para la operacin
Adicin de polmeros no
inicos
Polietilenglicol Reduccin en la cantidad efectiva de agua disponible
para solvatacin de protena; polmero a menudo tiene
un efecto estabilizador sobre las protenas
Adicin de polmeros cargada Polietienamino
cido poliacrlico
Formacin de complejos entre las molculas cargadas
opuestamente conduce a cargar la neutralizacin y
precipitacin
Aumento de temperatura Mayor interaccin hidrofbica; utilizado para la
precipitacin de protenas sensibles de calor
Cambio en pH Baja solubilidad de la protena en punto isoelctrico
extremos de pH desnaturaliza y precipitar protenas
sensibles
ADSORCIN
La adsorcin sobre
materiales insolubles,
por tandas, ha sido muy
utilizada.
El principio de
adsorcin que se aplica
es habitualmente el del
intercambio inico.
Tres tipos de materiales:
Resinas
dextranos sustituidos o
agarosa
celulosas sustituidas.
Adsorcin no especfica
HA
Celita
ADSORCIN CON CROMATOGRAFA?
Las operaciones de adsorcin y elucin se
suelen desarrollar por tandas, en vez de en
columnas de cromatografa.
Debido a la magnitud del volumen de extracto
turbio que hay que procesar y problema de la
compresibilidad del material de adsorcin; a
pesar del relativamente bajo grado de
resolucin obtenible.
RESINAS
Las resinas de intercambio inico: los
poliestirenos sulfonados
resultan en la prctica de poca utilidad para la
adsorcin de protenas, porque su alto grado de
sustitucin puede causar la desnaturalizacin.
La excepcin a esto es su uso con protenas de punto
isoelctrico particularmente alto, como el
citocromo c.
OTROS ADSORBENTES
Las celulosas sustituidas, los dextranos y las
agarosas, aunque a gran escala tienden a
resultar caras.
ADSORCIN NO ESPECFICA
Los materiales como la CELITA y el
HIDROXIAPATITO, interaccionan con las
protenas de modo relativamente inespecfico
Son muy utilizadas debido a su bajo coste.
El HIDROXIAPATITO permite eluir de manera
diferencial las muchas protenas que retiene,
aumentando progresivamente la
concentracin de fosfato.
PROCEDIMIENTO
1. Los materiales adsorbentes tpicos se aaden al
extracto
2. Remover durante un rato, se sedimentan en
una centrfuga basculante.
3. El material adsorbente se resuspende a
continuacin en un medio de fuerza inica
mayor o de pH distinto, o las dos cosas,
4. Y se vuelve a centrifugar de nuevo.
ELUCIN: Bajas concentraciones de fosfato de pH
6,8; presencia de sales NaCl, KCl y CaCl2.
Se puede realizar la adsorcin por tandas, y la
elucin en columna.
Protenas

poseen aa cargados
en su superficie, se adsorben
sobre el intercambiador
Protenas con carga neta
negativa se absorben a I.
catinicos,
La fuerza de adsorcin aumenta
con el aumento de carga neta.
La carga de los aa depende del
pH.
la carga neta depender del pH
de una manera que es bastante
especfica para cada protena
individual.
El tamao de la fecha
representa la fuerza de la
adsorcin
CARACTERSTICA
MOLECULAR
APROVECHADA
TIPO DE
CROMATOGRAFA
CARACTERSTICAS APLICACIN
Tamao
Filtracin en gel Resolucin moderada para el
fraccionamiento y buena para tampones
intercambiadores.
Capacidad limitada por el volumen de la
muestra
El fraccionamiento es mejor en las
ltimas etapas de la purificacin.
En cualquier momento se pueden
usar tampones intercambiadores y
podr existir una limitacin respecto
al volumen de muestra
Carga
Intercambio inico





Cromatoenfoque
La resolucin puede ser alta. Capacidad
alta no limitada por el volumen de la
muestra.
La velocidad puede ser muy elevada
dependiendo de la matriz.

La resolucin puede ser alta. La capacidad
puede ser alta. La velocidad puede ser alta
Es ms efectiva en las primeras fases
del fraccionamiento cuando se van a
manipular grandes volmenes.



Es mejor usarla en una purificacin
posterior, ya que las matrices son
caras.
Polaridad
Interaccin
hidrofbica
Resolucin buena
Capacidad muy alta y no limitada por el
volumen de muestra.
Velocidad alta
Puede ser utilizada en cualquier fase,
pero es mejor aplicarla cuando la
fuerza inica es alta tras la
precipitacin con sales o despus de
un intercambio inico
Afinidad
biolgica
Afinidad La resolucin puede ser elevada.
Capacidad puede ser alta o baja,
dependiendo del ligando y no limitada por
el volumen de la muestra. Velocidad alta.
Puede emplearse en cualquier etapa,
aunque normalmente no es
recomendable en las primeras fases
TIPOS DE CROMATOGRAFA
CROMATOGRAFIA DE INTERACCIONES
HIDROFBICAS (HIC)
La fase estacionaria son generalmente
compuestos alifticos de distinta longitud de
cadena (C4, C8, C16 etc)
Elucin por gradiente (usando mezclas de
agua y solventes orgnicos)
Muy alta capacidad resolutiva (mezclando
distintas propiedades fisicoquimicas)

FUNDAMENTO
Las protenas se unen reversiblemente a
ligandos hidrofbicos que se encuentran
inmovilizados en el soporte cromatogrfico,
debido a la presencia de una elevada
concentracin de sal.
La elucin se logra disminuyendo la fuerza
inica en la fase mvil, formando un gradiente
decreciente (Fausnaugh y Regnier, 1986).
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA
La fase mvil es lquida
Particin o reparto
Adsorcin
Intercambio inico
Exclusin molecular
CARACTERSTICAS Y VENTAJAS
Trabaja con partculas muy
pequeas (< 10 mm).
Presiones de 1000 - 6000 psi
(pounds square inch = libras por
pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7).
Rpida.
Picos angostos (alta eficiencia).
Separa compuestos no-voltiles o
trmicamente inestables.
BOMBA
INYECTOR
CMARA DE
MEZCLA
PRE-COLUMNA
DETECTOR
COLUMNA
ESQUEMA DEL EQUIPO DE HPLC
SEPARACIN EN DOS FASES LQUIDAS
VENTAJAS
La fcil separacin de protenas por un lado y
paredes celulares y residuos semisolubles por
otro.
La posibilidad de funcionar en continuo.
FUNDAMENTO
En la observacin de que al poner en contacto
una solucin de protenas con una mezcla de dos
polmeros inmiscibles, los dos polmeros se
separan en fases distintas y las protenas quedan
selectivamente repartidas entre una fase y la otra.
La razn de esta separacin son las caractersticas
fsicas de las molculas implicadas.
Las molculas idnticas o similares tienen mayor tendencia a
agregarse entre s, que a hacerlo con molculas diferentes.
Fase superior (rica en PEG): Protenas hidrofbicas
Fase inferior: Protenas hidroflicas
Un sistema de dos fases tpico podra estar constituido:
Mezcla de polietilenglicol (PEG) y dextrano, o polietilenglicol y
sulfato amnico.
La fase en la que se localice una determinada protena
depender:
Su propio peso molecular
El peso molecular y concentracin de los polmeros
As como de la temperatura, el pH y la fuerza inica.
Una vez mezclados los ingredientes, la separacin en
fases se realiza por decantacin o centrifugacin
(posiblemente en continuo).
SEPARACIN EN DOS FASES LQUIDAS